煙草打頂前后根尖組織SSH-cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與分析.pdf

1、煙堿是煙草特有的生物堿,是煙草根系合成的次生代謝產(chǎn)物。煙堿自精氨酸或鳥(niǎo)氨酸途徑形成吡咯環(huán),自天冬氨酸途徑形成嘧啶環(huán),最終兩環(huán)縮合形成煙堿的生物合成途徑己被研究的相當(dāng)清楚。打頂以后,煙株體內(nèi)煙堿含量大量積累,然而對(duì)造成煙株體內(nèi)煙堿含量升高的因?yàn)橐约盁焿A合成的調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。生物堿生物合成的可誘導(dǎo)性特點(diǎn)表明,生物堿合成過(guò)程必定是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果,盡管已有很多生物堿合成的關(guān)鍵基因被克隆,可被證實(shí)的參與生物堿合成的調(diào)控基因卻很少。因此,用抑制性

2、消減雜交的方法構(gòu)建打頂前后的SSH—cONh文庫(kù),篩選差異表達(dá)的基因,為揭示打頂對(duì)煙堿含量影響的分子基礎(chǔ)具有很大的潛力。
　　 本研究～K326為材料進(jìn)行打頂24h處理,打頂煙株為實(shí)驗(yàn)組(tester),不打頂煙株為對(duì)照組(driver)和不打頂煙株為實(shí)驗(yàn)組(tester),打頂煙株為對(duì)照組(driver),采用高靈敏度和高產(chǎn)出率的抑制差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建煙草打頂前后根尖組織的SSH—cDNA文庫(kù),得到兩個(gè)各含1000個(gè)克

3、隆的正反向消減文庫(kù)。通過(guò)篩選文庫(kù)獲得陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析,以期從基因組水平探討煙堿生物合成的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果為:
　　 (1)應(yīng)用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了煙草打頂前后根尖組織的cDNA文庫(kù),克隆轉(zhuǎn)化后經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)cDNA插入片段大小主要分布在200—700bp之間,符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期要求,為高效篩選差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 (2)利用反向Nor‘thern雜交對(duì)經(jīng)菌落PCR初步驗(yàn)證

4、得到的1300個(gè)克隆進(jìn)行篩選,從中篩選到450個(gè)雜交信號(hào)差異明顯的克隆,進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ESTs生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了一些參與調(diào)控?zé)焿A合成的基因和轉(zhuǎn)錄因子,利用半定量RT—PCR驗(yàn)證3個(gè)EST序列(PMT、ODC、gABS-box)表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)在打頂后這3個(gè)EST序列的表達(dá)量增強(qiáng)。
　　 (3)將獲得的非冗余EST序列進(jìn)行功能注釋,發(fā)現(xiàn)我們克隆的很多基因參與植物體內(nèi)的代謝活動(dòng),如植物激素的合成、植物的次生代謝過(guò)程等,這