Tru-RGNs介導(dǎo)CRISPR-Cas9對(duì)小鼠第七凝血因子基因編輯的研究.pdf

1、CRISPR/Cas9是一項(xiàng)嶄新而高效的基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于微生物、植物與動(dòng)物的基因改造。為提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率，有多種方法對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)。有報(bào)道證明由截短的gRNA(tru-RGNs，17/18 nt)所介導(dǎo)的Cas9核酸酶在人體細(xì)胞的基因修飾過程中可顯著地降低脫靶效應(yīng)，但不影響其靶向效率。但尚無研究表明該方法能用于構(gòu)建基因敲除(KO)動(dòng)物。本研究將揭示tru-RGNs對(duì)小鼠細(xì)胞基因組編輯的特異性，并應(yīng)用tr

2、u-gRNA和Cas9 mRNA快速構(gòu)建FVⅡ KO小鼠模型。
　　本論文選擇小鼠FVⅡ基因第二外顯子（啟動(dòng)子下游）作為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)識(shí)別三個(gè)不同位點(diǎn)的tru-RGNs，構(gòu)建三組tru-RGNs(tru-gRNA+ Cas9)表達(dá)載體，將它們轉(zhuǎn)染到小鼠的NIH/3T3細(xì)胞中，std-RGNs(20 nt)作為對(duì)照。結(jié)果顯示，ctF7-2相對(duì)于cF7-2突變率明顯提高(49.5％ vs30.1％)，ctF7-1與ctF7-3相對(duì)于cF

3、7-1與cF7-3突變率略有下降(ctF7-1，12.1％ vs cF7-1，23.6％;ctF7-3，7.7％vs cF7-3，10.9％)(P＜0.05)。對(duì)其脫靶檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們?cè)陬A(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)上均出現(xiàn)脫靶，tru-RGNs vs std-RGNs脫靶突變無顯著差別。在小鼠水平，將tru-gRNA與std-gRNA和Cas9片段通過T3啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄RNA共注射小鼠胚胎。Tru-gRNA(tF7-1，tF7-2，tF7-3)和C

4、as9 mRNA一起注射胚胎，分別注射胚胎98枚，75枚和120枚，出生小鼠38只，20只，20只;std-gRNA(F7-1，F(xiàn)7-2，F(xiàn)7-3)和Cas9 mRNA作為對(duì)照，分別注射胚胎78枚，110枚和80枚，出生小鼠18只，24只，6只。出生小鼠經(jīng)引物F7-667-f1/F7-667-r1 PCR擴(kuò)增后，T7EI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變，結(jié)果顯示tF7-1，tF7-2，tF7-3分別有19只(55.0％)，15只(80.1％)，8只(39.

5、4％)檢測(cè)到突變，F(xiàn)7-1，F(xiàn)7-2，F(xiàn)7-3分別有1只(3.7％)，8只(35.8％)，2只(27.8％)。對(duì)其脫靶檢測(cè)，除了tF7-3在預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)有突變(OT3-2，29.3％)，其余小鼠中沒有檢測(cè)出脫靶突變。F0 FVⅡ KO小鼠凝血酶原時(shí)間測(cè)定，與野生型小鼠相比，其凝血酶原時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，Western blot顯示，其第七凝血因子表達(dá)量低于1/2WT。將F0代陽性小鼠進(jìn)行繁殖，出生小鼠T7EI檢測(cè)到突變鼠，說明