細胞內RT-PCR聯(lián)合流式細胞術檢測白血病分子標志和殘留白血病的研究.pdf

1、第一部分細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合流式細胞術檢測 BCR/ABL融合基因方法的建立 目的：本研究擬將FISH、PCR和FCM三種先進檢測技術結合起來，建立起一種快速、敏感、特異的臨床上實用的檢測分子標志的方法。 材料和方法：1.研究對象：陽性細胞系(攜帶有BCR-ABL融合基因)：K562細胞系；陰性細胞系(不攜帶BCR-ABL融合基因)：NB4細胞系。 2.方法：培養(yǎng)收集K562細胞和NB4細胞，用多聚甲醛固定

2、細胞(不同濃度，不同時間，選擇最佳固定濃度及最佳固定時間)，然后用蛋白酶K對細胞進行通透化處理(不同濃度，不同時間，選擇最佳濃度及最佳時間)，細胞內反轉錄獲cDNA(優(yōu)化反轉錄條件)，用LUX熒光引物進行細胞內PCR擴增(優(yōu)化PCR條件)，用熒光顯微鏡和FCM分析結果。將K562細胞與正常人骨髓單個核細胞以1:100至1： 100000不同比例混合，同時用普通RT-PCR和細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合FCM分析BCR/ABL融合基因轉錄，

3、鑒定其敏感性。 結果：1.在K562細胞系，99～100％的細胞呈陽性，表現(xiàn)出圍繞細胞核出現(xiàn)較強的黃綠色熒光信號。而在NB4細胞系和正常對照則無陽性信號發(fā)現(xiàn)。 2.用細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合流式細胞術檢測BCR-ABL融和基因，當K562細胞與正常細胞的比率小于1/104時，用流式細胞檢測不到陽性信號。 3.普通RT-PCR:在K562細胞與正常細胞的比率小于1/104 時，BCR/ABL融合基因陰性。

4、 結論：1.LUX引物可以用于細胞內RT-PCR。 2.細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合流式細胞術可以用來定量檢測BCR-ABL融和基因轉錄，其敏感性與普通RT-PCR相同。 第二部分用細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合流式細胞術檢測 CML患者BCR/AB L融合基因 目的：細胞內熒光RT-PCR聯(lián)合流式細胞術定量檢測12例CML患者的骨髓細胞BCR/ABL融合基因轉錄情況，并與RT-PCR及FISH結果相比較，來驗證此方法

5、的敏感性、特異性及實用性。 材料和方法：1.研究對象：選擇2006-2007年間在我院治療的12例CML患者，其中 5例為初治患者， 3例為干擾素聯(lián)合羥基脲治療患者，治療時間6-16個月， 4例為伊馬替尼治療患者，治療時間為2-12個月。 2.方法：分離骨髓單個核細胞，用4％的多聚甲醛固定細胞后，用蛋白酶K(1 ug/ml)對細胞進行通透化處理，用LUX引物在懸浮的細胞內進行mRNA的逆轉錄和DNA的擴增，用熒光顯微鏡和

6、流式細胞術分析結果。所有標本同時用普通RT-PCR和FISH檢測BCR/ABL融合基因情況，并比較其結果。 結果：1.RT-PCR的結果：9個慢性粒細胞白血病病人，包括5個初診病人，3個用α-干擾素和羥基脲治療后的病人和1個服用伊馬替尼2個月的病人， RT-PCR.結果陽性；而其他3個病人，正常對照和NB4細胞系，RT-PCR結果陰性。 2.I-FISH結果：對照組5份標本BCR-ABL融合基因陽性細胞檢出率為1.5～4.1％，

7、平均值為2.28％，標準差為0.6 1％，分界值為4.11％。初診的5個病人陽性細胞率86～96.5％；4個治療后病人，包括3個用α-干擾素和羥基脲治療后的病人和1個服用伊馬替尼的病人，細胞陽性率為23～80％；其他3個用伊馬替尼治療的病人和NB4細胞系為BCR-ABL融合基因陰性(陽性細胞率＜4.11％)。 3.細胞內RT-PCR結果：在12個CML病人中，5個初診的病人，陽性細胞率為90～98％，3個用干擾素和羥基脲治療的病