DAPT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29中Notch4、DLL1及ALDH1的影響.pdf

1、目的：本課題旨在研究Notch信號(hào)通路阻斷劑γ-分泌酶抑制劑（GSIs）DAPT作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29后，初步探索Notch信號(hào)通路中受體Notch4、配體DLL1與結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1在細(xì)胞中的表達(dá)情況及相關(guān)性，為結(jié)直腸癌的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：本次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株。首先在條件為37℃，20％O2,5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中，體外培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別

2、用于以下各步試驗(yàn)。(1)用細(xì)胞免疫組化檢測(cè)HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4及DLL1表達(dá)的情況及不同濃度DAPT對(duì)HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4及DLL1表達(dá)的影響,圖像分析系統(tǒng)計(jì)量。(2)不同DAPT濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）作用于結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察不同濃度DAPT對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)影響；用MTT比色法檢測(cè)不同濃度DAPT對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用。(3)運(yùn)用rea

3、l-time PCR技術(shù)、Western-Blot技術(shù)檢測(cè)DAPT作用HT-29細(xì)胞前后，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化及相關(guān)性。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示ALDH1、Notch4、DLL1在HT-29細(xì)胞中均有表達(dá)，當(dāng)加入 DAPT后，與對(duì)照組相比 ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表達(dá)降低（P<0.05），且隨著DAPT濃度的增加降低更明顯，存在濃度依賴性。
　　(2)

4、不同DAPT終濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）作用于結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，顯微鏡下觀察HT-29細(xì)胞具有典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。MTT法檢測(cè)各濃度組分別與對(duì)照組相比較，對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：24h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為0%、0.22%、5.85%、11.41%、13.82%、18.59%；48h分別為0%、6.06%、16.8%、25.44%、44.25%、56.73%；72h分別為0%、6.9%、4.86%、

5、27.6%、51.59%、67.78%。隨著DAPT作用濃度和時(shí)間的增加，其對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增大，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，呈時(shí)間和劑量依賴性。濃度為40、80μmol/L的DAPT在48h、72h分別與24h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)20、40μmol/LDAPT作用HT-29細(xì)胞48小時(shí)后，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白的表達(dá)情況及相關(guān)性：在 H

6、T-29細(xì)胞中 ALDH1表達(dá)在 Notch4和DLL1表達(dá)下調(diào)時(shí)也下調(diào)(P<0.05），且ALDH1、Notch4及DLL1的蛋白表達(dá)在藥物濃度20與40μmol/L之間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。ALDH1mRNA與Notch4mRNA表達(dá)有關(guān)（P<0.05）；Notch4mRNA與DLL1mRNA表達(dá)有關(guān)（P<0.05）；ALDH1mRNA與DLL1mRNA表達(dá)無關(guān)（P<0.05）。ALDH1與Notch4的蛋白表達(dá)有關(guān)（

7、P<0.05）；Notch4與DLL1的蛋白表達(dá)有關(guān)（P<0.05）；ALDH1與DLL1的蛋白表達(dá)無關(guān)（p>0.05）；可見，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義一致，三者之間可能存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：(1)Notch4、DLL1和ALDH1在人的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中均有表達(dá)。
　　(2)DAPT能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的體外增殖，這種抑制作用在一定范圍內(nèi)具有時(shí)間和濃度的依賴性。