小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道在小鼠房室結(jié)細(xì)胞的表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、研究背景及目的： 房室結(jié)(atrioventricular node，AVN)是位于右心房和心室之間高度特化的傳導(dǎo)組織，是唯一連接心房和心室之間的傳導(dǎo)通道，也是興奮由心房進(jìn)入心室的唯一電信號通道。它的重要功能是保證心房和心室在不同的時間內(nèi)有序的收縮。房室結(jié)的傳導(dǎo)速度很慢，其中，以結(jié)區(qū)的傳導(dǎo)速度為最慢。這一慢的傳導(dǎo)將導(dǎo)致心房和心室之間的收縮延遲，以保證心室不會與心房發(fā)生同步收縮。在某些病理情況下，房室結(jié)具有進(jìn)一步的功能，例如，竇房

2、結(jié)起搏點或心房傳導(dǎo)障礙，房室結(jié)將以它固有的自律性成為心室工作的起搏點。 盡管，已知房室結(jié)的重要功能和意義，但對其電生理機理仍不明確。已有研究表明某些離子通道及離子通道基因表達(dá)在心肌細(xì)胞，包括自律細(xì)胞，例如，心臟起搏組織竇房結(jié)和房室結(jié)存在小電導(dǎo)-Ca<'2+>-激活K<'+>通道(small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel)。SK通道是K<'+>

3、選擇性，非電壓依賴性，唯一通過細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>激活的一種鉀通道。在哺乳動物腦內(nèi)，SK通道主要有3種亞型：SK1、SK2和SK3通道，它們對蜂毒明肽(apnmin)-SK通道的阻斷劑的敏感性不同，其中，SK2通道對apamin最敏感，其次是SK3通道，SK1對apamin的敏感性較低。迄今為止,已編碼至少3個明確的SK通道基因，即KCNN1(SK1)、KCNN2(SK2)和KCNN3(SK3)。 SK通道廣泛存在于機體不同的組

4、織，包括腦、周圍神經(jīng)、肝臟和平滑肌。SK通道在心臟表達(dá)的功能意義，鮮為人知。Dr.Chimnvimonvat實驗室近來證明人和小鼠心肌細(xì)胞存在SK2通道，明顯參與動作電位的復(fù)極化過程，且在心房的表達(dá)明顯高于心室。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SK2通道的小鼠易發(fā)生心律失常，并伴有明顯的房室結(jié)功能及房.室傳導(dǎo)異常。本研究采用SK2通道過表達(dá)小鼠和SK2通道敲除小鼠，分別檢測了它們對房室結(jié)功能的影響，首次證明了SK2通道在房室結(jié)的重要功能意義。通過

5、建立HEK(Human embryonic kidney)293細(xì)胞SK2通道表達(dá)細(xì)胞株，探討了SK2通道的調(diào)節(jié)及其與a-actinin2(肌動蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)合蛋白)相互作用的分子機理。 方法： 1.本研究采用16-22 W，體重20-25g,具有C57B1/6J背景的SK2通道過表達(dá)小鼠(SK2+/T)，SK2通道敲除小鼠(SK2+/Δ，SK2Δ/Δ)及SK2野生型小鼠(Wild-type，WT)，雌雄不拒。

6、 2.動物心電圖(Electroc,ardiogram，ECG)記錄：上述3組動物，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉(60mg/kg)，37℃條件下行肢體導(dǎo)聯(lián)記錄。 3.AVN自發(fā)性動作電位(action potential，AP)記錄：動物麻醉同上，取出心臟，暴露右心房，分離房室結(jié)區(qū)。采用3 mol/L KCI微電極細(xì)胞內(nèi)記錄SK2+/T、SK2+/Δ及WT組房室結(jié)自發(fā)性AP。 4.AVN細(xì)胞分離及全細(xì)胞IK,ca的記錄：WT、

7、SK2+/T and SK2+/Δ小鼠AVN單個細(xì)胞的分離參照以往的方法并進(jìn)行改良。單個AVN細(xì)胞Ca<'2+>激活K<'+>電流(Cd<'2+>.activited K<'+>current，IK ca)的記錄采用全細(xì)胞膜片鉗法，鉗制電壓為-55mV，給予階梯去極化脈沖刺激從-90mV～+40mV，濾波2 KHz，采樣頻率10 KHz。記錄給予apamin(500 pmol/L)前后的lgca，室溫下進(jìn)行。Apamin-敏感K<'+>

8、電流的計算為apamin(500 pmol/L)給藥前后Ik,ca電流密度的差(值)。 5.雙重免疫組化熒光標(biāo)記：取WT和SK2Δ/Δ小鼠新鮮分離的心肌細(xì)胞，4％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封閉，加入一抗，4℃過夜。雙重免疫組化熒光標(biāo)記分為2組①抗SIC7.抗體(1：100稀釋)+α-actinin2抗體(1：800)；②抗SK2抗體(1：100)+抗NF 160KD(neurofilament 160 KD，NFl60 KO

9、)抗體(1：100)。二抗為FITC-羊抗兔IgG(1：250)和TEXRED-羊抗鼠IgG(1：250)。以二抗作為陰性對照，同時進(jìn)行。 6.免疫組織化學(xué)：制備WT及SK2基因敲除小鼠(SK2△/△)心臟石蠟系列切片.各取WT及SK2△/△相鄰心臟切片，5％羊血清封閉，抗SK2抗體(1：200)與切片孵育，4℃過夜，再與生物素標(biāo)記的二抗反應(yīng)。 7.建立SK2通道表達(dá)的HEK293細(xì)胞株：HEK293細(xì)胞株在Dulbec

10、co's modified Eagle's培養(yǎng)液常規(guī)條件下培養(yǎng)并傳代(37℃ in an air/5％CO2)。參照 Lipofectamine<'TM>2000試劑盒說明書，下列質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞：1) pSK2-IRES-EGFP&pcDNA3-α-actinin2：2)pSK2-IRES-EGFP。 8.膜片鉗記錄：轉(zhuǎn)染后36～48 hrs的HEK293細(xì)胞在室溫條件下行全細(xì)胞膜片鉗Ikca記錄。記錄前4hrs

11、，將已轉(zhuǎn)染SK2+和α-actinin2質(zhì)粒的細(xì)胞給予Cytochalasin D(CyD，2.5μmol/L)。IK,ca記錄程序和條件同上述AVN細(xì)胞。 9.HEK293細(xì)胞SK2和a-actinin2蛋白的表達(dá)：Western blot檢測共轉(zhuǎn)染α- actinin2和SK2的HEK293細(xì)胞α-actinin2和SK2蛋白的表達(dá)。 10.免疫組化熒光標(biāo)記：將共轉(zhuǎn)染SK2+α-actinin2質(zhì)粒后2-3 day的

12、細(xì)胞2％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封閉，加入抗SK2抗體(1：100)+抗α-actinira.抗體(1：800)，0C過夜。二抗為FITC-羊抗兔IgG(1：250)和TEXRED-羊抗鼠IgG(1：250)。 結(jié)果 1.SK2+/T和SK2+/△小鼠顯示竇房結(jié)和AVN功能異常：心電圖的記錄表明SK2+/△小鼠與wT比較，P-R間期明顯延長，并伴有竇性心動過緩。相反，SK2+/Tr小鼠R-R問期及P-R間期明顯縮短

13、。提示過表達(dá)SK2基因和SK2基因敲除小鼠存在竇房結(jié)和房室結(jié)起搏功能和房.室傳導(dǎo)功能的明顯異常。 2.SK2+/T小鼠AVN著火率增加，相反的結(jié)果見SK2+/△小鼠：分離的AVN自發(fā)性AP具有慢的4期自動去極化，且除極速率慢，無明顯超射。這些特征表明其自發(fā)性AP來自AVN。與WT比較，SK2+/T組AvN自發(fā)性AP的頻率增加。而SK2+/△小鼠AVN著火頻率明顯減小。詳細(xì)分析自發(fā)性AP發(fā)現(xiàn)其周期長度(cycle-length，C

14、L)、動作電位持續(xù)時間(action potential duration，APD)及舒張期自動去極化速度(the rate of diastolic depolarization，DDR)有明顯變化。與WT比較，過表達(dá)SK2通道引起AP復(fù)極達(dá)80％(APD80)的時間縮短，DDR增快及相應(yīng)的CL縮短。相反的結(jié)果見于SK2通道缺失小鼠。結(jié)果表明，SK2通道表達(dá)異?？擅黠@影響AVN細(xì)胞自發(fā)性著火頻率，進(jìn)而影響心臟房- 室傳導(dǎo)。 3

15、．單個AVN細(xì)胞IK,ca的變化：電流密度．電壓關(guān)系曲線證明這一電流具有內(nèi)向整流的特征，通道電流的大小隨電壓升高而減低，亦與時間無關(guān)，其電流的外向及內(nèi)向成份都可被apamin所阻斷。反轉(zhuǎn)電位約-80 mV，符合Nernst方程。 SK2+/T小鼠，其AVN細(xì)胞appamin敏感K<'+>電流明顯大于WT；而SK2通道敲除小鼠，其apamin敏感K<'+>電流明顯小于WT。結(jié)果表明房室結(jié)細(xì)胞存在apamin敏感的IK,ca。推測其IK,c

16、a的變化是AVN細(xì)胞自發(fā)性AP改變的直接原因。 4．激光共聚焦顯微鏡：單個AVN細(xì)胞具有對特異性SK2抗體的免疫陽性反應(yīng)。心房和心室細(xì)胞也具有SK2蛋白的陽性信號。NF160作為心臟起搏組織和傳導(dǎo)系統(tǒng)的標(biāo)志，其陽性反應(yīng)僅見于AVN細(xì)胞，以區(qū)別心室或心房細(xì)胞。 5．AVN SK2免疫陽性反應(yīng)：心臟組織切片AVN，心房及室間隔均可見SK2蛋白陽性反應(yīng)(棕色)。與WT比較，無明顯陽性反應(yīng)呈現(xiàn)于SK2△/△小鼠心肌組織，包括AV

17、N。結(jié)果表明SK2免疫陽性反應(yīng)存在于房室結(jié)。采用H&E和Tfichrome染色進(jìn)一步鑒定了AVN的解剖部位。 6．A-actinin2對HEK293細(xì)胞IK,ca的調(diào)節(jié)：共表達(dá)a-actinin2和SK2細(xì)胞的IK,ca電流密度明顯大于僅表達(dá)SK2細(xì)胞的電流密度，IK,ca電流密度增加了4倍。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，無明顯IK,ca電流。Cytochalasin D預(yù)處理共表達(dá)α-actinin2和SK2通道的細(xì)胞，以阻斷細(xì)胞骨架蛋白與S