擬Smac新型促凋亡多肽分子對(duì)凋亡下游蛋白質(zhì)組的影響及誘導(dǎo)凋亡的研究.pdf

1、本研究分為六部分：
　　 實(shí)驗(yàn)一：擬Smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究
　　 目的：探討擬Smac 多肽的合成及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的促凋亡生物活性。
　　 方法：應(yīng)用固相多肽合成技術(shù)，合成具有細(xì)胞膜穿透性SmacN7 融合多肽，經(jīng)RP-HPLC 純化、純度分析，用質(zhì)譜儀定性鑒定；通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)、細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定及流式細(xì)胞儀分析，研究其對(duì)低劑量絲裂霉素C誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用

2、。
　　 結(jié)果：可穿透性融合多肽SmacN7 產(chǎn)物峰純度達(dá)95%以上，分子量為3278.08，質(zhì)譜鑒定結(jié)果與合成預(yù)期結(jié)果完全一致；50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用12h～48h，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；隨著SmacN7 濃度的增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯增加，藥物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分別為（9.62±1.07）%～（61.48±1.15）%、（24.17±1.02）%

3、～（72.86±1.68）%、（43.24±1.15）%～（84.91±1.74）%；腫瘤細(xì)胞凋亡率也明顯增加，分別為（6.12±1.16）%～（49.81±2.11）%、（13.47±1.15）%～（64.54±2.27）%、（28.91±1.08）%～（82.36±2.19）%。
　　 結(jié)論：固相合成的擬Smac 融合多肽SmacN7 為高純度的目的肽，能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)且利用率高，并有明顯促進(jìn)低劑量絲裂霉素C誘導(dǎo)的膀胱癌

4、T24細(xì)胞凋亡的生物活性，為進(jìn)一步研究膀胱腫瘤的生物治療積累了有價(jià)值的資料。
　　 實(shí)驗(yàn)二：人工合成擬Smac 融合多肽促低劑量絲裂霉素C誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的研究
　　 目的：探討人工合成擬Smac 融合多肽（SmacN7）對(duì)低劑量絲裂霉素C(MMC)誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。
　　 方法：運(yùn)用固相多肽合成技術(shù)人工合成SmacN7細(xì)胞可穿透性融合多肽，0.05mg/ml MMC誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞與

5、50 μg/L～500 μg/L的SmacN7 融合多肽共同孵育4h～48h后，采用Annexin－V熒光染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)和MTT 比色檢測(cè)誘導(dǎo)后T24細(xì)胞凋亡率、增殖抑制率與SmacN7的時(shí)間和濃度效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)果：50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用4h～48h，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，隨著SmacN7 濃度的增加或藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞凋亡率也增加，12h 為5.67%～

6、56.12%，24h 為14.54%～65.24%，48h 為31.48%～87.23%，同時(shí)細(xì)胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯增加，藥物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分別為9.58%～63.42%、28.94%～72.3%、44.7%～87.12%。
　　 結(jié)論：SmacN7 能夠有效地促進(jìn)低劑量絲裂霉素C誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，并具有時(shí)間和濃度依賴性，為膀胱腫瘤的生物治療提供了新思路。
　　 實(shí)驗(yàn)三：人工合成擬Sma

7、c多肽增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討人工合成擬Smac細(xì)胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7對(duì)膀胱癌化療藥物敏感性的促進(jìn)作用。
　　 方法：人工合成細(xì)胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7；噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)SmacN7 融合多肽對(duì)低劑量絲裂霉素C(MMC)誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞的相對(duì)存活率；Annexin V/PI 雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T24細(xì)胞的凋亡；Western blot檢測(cè)SmacN7融合多

8、肽與MMC 聯(lián)用后T24細(xì)胞內(nèi)XIAP、Caspase-3 蛋白的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)Caspase-3活性及SmacN7 融合多肽與MMC 聯(lián)用對(duì)T24細(xì)胞的殺傷作用。
　　 結(jié)果：SmacN7 融合多肽能穿透細(xì)胞并與內(nèi)源性XIAP結(jié)合，增加低劑量MMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡并呈時(shí)間和濃度依賴性；能顯著降低細(xì)胞內(nèi)XIAP的表達(dá)水平，增強(qiáng)Caspase-3的表達(dá)及活性；在24h和48h，SmacN7+MMC組與單用MMC組相比，T24細(xì)

9、胞的存活率分別降低2.22 倍和3.61 倍。
　　 結(jié)論：人工合成擬Smac細(xì)胞可穿透性促凋亡融合多肽能夠促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)MMC的化療藥物敏感性。
　　 實(shí)驗(yàn)四：擬Smac合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物的制備及性能研究
　　 目的：探討擬Smac合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物的制備及聯(lián)合恒定外磁場(chǎng)體外對(duì)膀胱癌細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用。
　　 方法：以羧

10、甲基殼聚糖為骨架與具有超順磁性的Fe3O4納米粒合成納米載體粒子，將擬Smac 合成肽SmacN7與其結(jié)合，制備擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物，并通過透射電鏡、振動(dòng)樣磁強(qiáng)計(jì)等考察其理化性質(zhì)；Hoechst33258 染色觀察外加磁場(chǎng)下納米復(fù)合物誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的形態(tài)，MTT比色分析法觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 結(jié)果：擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米粒子的粒徑約為46.2nm；磁化曲線提示具

11、有超順磁性；載藥量和包封率分別為（31.8±3.6）％和（65.2±2.4）％并具有良好的藥物控釋性能；外加磁場(chǎng)下磁性納米粒子能使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)改變并表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)抑制活性。
　　 結(jié)論：擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物具有粒徑小、較強(qiáng)的磁響應(yīng)性、超順磁性、載藥量和包封率高和良好的藥物緩釋性能，聯(lián)合恒定外磁場(chǎng)具有明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為膀胱腫瘤的生物治療提供了新的切入點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)五：

12、擬Smac 合成肽磁性納米顆粒誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究擬Smac 合成肽磁性納米顆粒的制備及其協(xié)同恒定外磁場(chǎng)體外對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：氧化還原法制備SmacN7-O-CMC-MNPS 并檢測(cè)其理化性質(zhì)，倒置顯微鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，MTT、流式細(xì)胞術(shù)分別觀察SmacN7-O-CMC-MNPS 聯(lián)合化療藥物及恒定外磁場(chǎng)體外對(duì)人膀

13、胱癌T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，SABC法觀察Bcl-2/Bax 蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè)XIAP 蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒直徑46.2nm，呈球形，載藥量(31.8±3.6）%，磁響應(yīng)性良好。含相同濃度SmacN7的單純SmacN7-O-CMC-MNPS對(duì)膀胱腫瘤T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率無明顯影響，但協(xié)同外磁場(chǎng)及在化療藥物的誘導(dǎo)下其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明

14、顯增強(qiáng)；Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下調(diào)同時(shí)Bax 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，外磁場(chǎng)組與化療藥物組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），協(xié)同外磁場(chǎng)時(shí)Western blot檢測(cè)不同時(shí)間XIAP 蛋白的表達(dá)顯著降低。
　　 結(jié)論：SmacN7-O-CMC-MNPS的制備不影響SmacN7的生物活性；恒定外磁場(chǎng)下其對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用明顯增強(qiáng)，為膀胱腫瘤的生物靶向治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)六：擬Smac合成肽磁性納米顆粒在膀胱癌裸鼠移

15、植瘤靶向治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究
　　 目的：研究擬Smac合成肽磁性納米顆粒對(duì)膀胱癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)靶向治療作用并探討其機(jī)制。
　　 方法：40只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，按不同組別(A、B、C、D、E組)給于不同治療，各組每天治療1 次，連續(xù)1wk，磁場(chǎng)組在腫瘤部位施加0.8T外磁場(chǎng)30min。觀察裸鼠的進(jìn)食、活動(dòng)及生長(zhǎng)情況、測(cè)瘤體積并計(jì)算抑瘤率；治療后32d處死動(dòng)物，HE染色和電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，采用SABC法

16、觀察Bcl-2/Bax 蛋白的表達(dá)，采用RT—PCR法檢測(cè)各組腫瘤組織XIAPmRNA和Caspase-3mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)各組腫瘤組織XIAP和Caspase-3 蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：治療期間及治療后各組裸鼠的進(jìn)食、活動(dòng)及生長(zhǎng)情況未見明顯異常，體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加MMC 聯(lián)合外加磁場(chǎng)組（E組）移植瘤體積增長(zhǎng)最為緩慢且對(duì)膀胱癌移植

17、瘤有明顯抑制作用，抑瘤率為58.4%，高于SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加MMC組（C組）(24.6%)和SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加外加磁場(chǎng)組（D組）(32.2%)；免疫組化SABC法檢測(cè)E組Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)同時(shí)Bax 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，與C、D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；RT—PCR結(jié)果示E組能顯著下調(diào)XIAPmRNA的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Caspase-3mRNA的表達(dá)；Wes