高糖培養(yǎng)下鼠腎小球系膜細胞中BH4的過量生成及其調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的：研究高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞( glomerular mesangial cells，MCs)中Janus激酶2(Janus Kinase2，Jak2)和信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducers and activators of transcription1，Stat1)表達的變化；進一步探討Jak2/Stat1通路對GTP環(huán)化水解酶1(GTP cyclohydrolase1，GTPCH1)和四氫生物蝶

2、呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的影響。
　　 方法：用傳代培養(yǎng)的大鼠MCs同步化后分組：正常糖濃度組（NG組，5.56mmol/L葡萄糖）、甘露醇對照組（MA組，5.56mmol/L葡萄糖+19.44mmol/L甘露醇）、高糖組（HG組，25mmol/L葡萄糖）、抗氧化劑組（HG+NAC組，25mmol/L葡萄糖+50μmol/LNAC）、Jak2抑制劑組(HG+AG490組，25mmol/L葡萄糖+10μ

3、mol/LAG490)、Statl抑制劑組(HG+Fludarabine組，25mmol/L葡萄糖+50μmol/LFludarabine)、GTPCH1抑制劑組(HG+DAHP組，25mmol/L葡萄糖+2mmol/LDAHP)、過氧化氫組（H2O2組，10-6mol/LH2O2）、過氧化氫聯(lián)合Jak2抑制劑組（H2O2+AG490組，10-6mol/LH2O2+10μmol/LAG490）、過氧化氫聯(lián)合Stat1抑制劑組（H2O2+

4、Fludarabine組，10-6mol/LH2O2+50μmol/LFludarabine）、過氧化氫聯(lián)合GTPCH1抑制劑組（H2O2+DAHP組，10-6mol/LH2O2+2mmol/LDAHP）。溶媒組(HG+DMSO組，25mmol/L葡萄糖+0.1％DMSO;H2O2+DMSO組，10-6mol/LH2O2+0.1％DMSO)。繼續(xù)培養(yǎng)10h后，采用RT-PCR法測定Jak2和GTPCH1 mRNA水平；Western b

5、lot法檢測細胞總Jak2(T-Jak2)、磷酸化Jak2(p-Jak2)、總Stat1(T-Stat1)、磷酸化Stat1(p-Stat1)及GTPCH1蛋白的變化；HPLC-FL法檢測GTPCH1的活性及細胞內(nèi)BH4的含量；流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 結(jié)果：所有結(jié)果均顯示，NG組與MA組比較，HG組與HG+DMSO組比較，H2O2組與H2O2+DMSO組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余相關(guān)指標變化如下：

6、r>　　 1．細胞中BH4含量的變化
　　 與NG組比較，HG組和H2O2組BH4含量均顯著增高(P＜0.01)；與HG組比較，HG+NAC組及HG+DAHP組BH4含量均明顯降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，H2O2+DAHP組BH4含量均明顯降低(P＜0.01)。
　　 2．GTPCH1 mRNA水平、蛋白表達以及酶活性的變化
　　 RT-PCR、Westem blot及HPLC-FL結(jié)果均顯示，與N

7、G組比較，HG組、H2O2組GTPCH1 mRNA水平和蛋白表達以及酶活性較NG組均顯著提高（P＜0.01）。與HG組比較，HG+NAC組、HG+AG490組及HG+Fludarabine組GTPCH1 mRNA水平、蛋白表達以及酶活性均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；與H2O2組比較，H2O2+AG490組及H2O2+Fludarabine組GTPCH1 mRNA水平、蛋白表達和酶活性均顯著降低(P＜0.01)。
　　

8、 3．Jak2蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結(jié)果顯示，各組間T-Jak2蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。與NG組比較，HG組、H2O2組p-Jak2/T-Jak2值顯著(P＜0．01)升高；HG+NAC組結(jié)果與HG組比較，p-Jak2/T-Jak2值顯著（P＜0.05）降低。
　　 4．Stat1蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結(jié)果顯示，各組間T-Stat1蛋白表達無

9、明顯變化（P＞0.05）。與NG組比較，HG組、H2O2組p-Stat1/T-Stat1值顯著升高（P＜0.05）；HG+AG490組、HG+NAC組結(jié)果與HG組比較，p-Stat1/T-Stat1值顯著降低(P＜0.05); H2O2+AG490組結(jié)果與H2O2組比較，p-Stat1/T-Stat1值明顯降低（P＜0.05）。
　　 5．各處理因素對細胞周期的影響
　　 與NG組比較，HG組及H2O2組，Go/G1期細

10、胞比例均明顯升高（P＜0.05），S期細胞比例明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+NAC組和HG+DAHP組的Go/G1期細胞比例均顯著降低（P＜0.05），S期細胞比例明顯升高（P＜0.05）：與H2O2組相比，H2O2+DAHP組Go/G1期細胞比例均有顯著降低(P＜0.01)，S期細胞比例明顯升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：在本實驗條件下得出如下結(jié)論：
　　 1．高糖誘導的氧化應激可增加大鼠MCs中B