PinX1基因聯(lián)合順鉑調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞端粒酶活性、抑制增殖遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma NPC)是我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤(發(fā)病率每年在10-150/1001000)，也是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，治療上以放療或輔助誘導(dǎo)化療加放療為主，但放化療導(dǎo)致的局部及全身后遺癥嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。并且，由于鼻咽癌的發(fā)病部位較為隱蔽，首診時(shí)多數(shù)患者已經(jīng)伴有淋巴結(jié)侵襲或和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，同步放化療成為局部晚期鼻咽癌患者治療的標(biāo)準(zhǔn)方式。但有報(bào)道化

2、療耐藥占到惡性腫瘤約75％左右，成為鼻咽癌治療失敗，出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、影響總體生存率的因素之一。目前，腫瘤多藥耐藥的機(jī)制還不清楚，如何逆轉(zhuǎn)耐藥提高治療效果成為鼻咽癌治療領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
　　 腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrug resistance MDR)是指細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)和功能均不同的化療藥物產(chǎn)生的耐藥性，分為原發(fā)性和獲得性耐藥，后者較為常見(jiàn)。研究MDR的分子機(jī)制，對(duì)于提高鼻咽癌患者的生存率，減少?gòu)?fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移極其重要。一些

3、研究表明，端粒長(zhǎng)度/端粒酶活性參與腫瘤MDR。我們課題組曾較為系統(tǒng)探討了端粒酶在鼻咽癌發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)端粒酶在鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌CD133+干細(xì)胞中高表達(dá)，靶向降低端粒酶活性可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及遷移。
　　 PinX1基因是近年在人和酵母菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能與端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白，是端粒酶結(jié)合蛋白pin2/TRF1相互作用的一種結(jié)合蛋白，并且是唯一能直接與端粒酶結(jié)合的一種端粒結(jié)合蛋白，高表達(dá)PinX1的C

4、-端片段能顯著抑制細(xì)胞端粒酶活性，縮短端粒并抑制端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外生長(zhǎng)，被有些學(xué)者認(rèn)為是一種內(nèi)源性的端粒酶抑制劑，我們的前期研究也證實(shí)了PinX1能降低鼻咽癌細(xì)胞株的端粒酶活性，并促進(jìn)該腫瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。在一系列前期研究工作的基礎(chǔ)上，本研究擬觀察PinX1基因在鼻咽癌細(xì)胞化療增敏、逆轉(zhuǎn)化療耐藥中的作用，并進(jìn)一步探討端粒酶、抗凋亡因子Bcl2及耐藥相關(guān)基因LRP在這一過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　 研究目的：
　　 觀

5、察PinX1基因聯(lián)合順鉑對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為基因聯(lián)合化療減低鼻咽癌化療抵抗提供理論依據(jù);探討端粒酶活性改變、抗凋亡基因Bcl-2及肺耐藥相關(guān)基因LRP對(duì)在上述過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 1、重組慢病毒的構(gòu)建及鑒定
　　 將含PinX1的質(zhì)粒連接到慢病毒穿梭載體上，并經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定確認(rèn)，與另外兩種輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集并濃縮重組病毒液，用濃度梯度法計(jì)算病毒滴度。

6、>　　 2、慢病毒感染鼻咽癌細(xì)胞、檢測(cè)感染前后PinX1的變化
　　 分別將慢病毒Lenti-PinX1和對(duì)照組慢病毒Lenti-Crtl感染過(guò)的鼻咽癌細(xì)胞命名為L(zhǎng)enti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F細(xì)胞。并用熒光定量PCR檢測(cè)Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F和5-8F細(xì)胞中基因mRNA的表達(dá)，Westernblotting檢測(cè)PinX1蛋白的表達(dá)。
　　 3、

7、PinX1聯(lián)合順鉑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響
　　 1)用MTT法檢測(cè)不同處理組鼻咽癌細(xì)胞株的體外增殖能力
　　 對(duì)感染前后的鼻咽癌細(xì)胞5-8F和Lenti-PinX1-5-8F加入不同濃度順鉑處理后，酶標(biāo)儀測(cè)570nm處的吸光度即OD(570)值，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，取各復(fù)孔的平均值為各組結(jié)果。然后，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，繪制生長(zhǎng)抑制曲線，并據(jù)Q=E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)計(jì)算PinX1與化療藥間的相互作用。

8、
　　 2) Hoechst33258染色對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察
　　 分別將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F以1×104/ml、500ul/孔接種到24孔板中.培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁后，PBS洗細(xì)胞兩次，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入500ul全培稀釋的順鉑（16ug/ml）或完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，4％多聚甲醛室溫固定細(xì)胞、1ug/ml的Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀

9、察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細(xì)胞，PBS洗滌、重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取1ml細(xì)胞懸液;1000rpm離心5min，棄上清;加入4℃預(yù)冷70％乙醇固定，經(jīng)PBS洗滌，加入100ul RnaseA37℃水浴30min;避光加入400ulPI染液4℃避光染色至少30 min;流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)
　　 4) Trans

10、well小室檢測(cè)不同處理后鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力
　　 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別給予全培稀釋的16ug/ml順鉑或全培繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化后用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛确N到上室內(nèi)，下室事先加入含20％胎牛血清的全培，37℃，5％CO2培養(yǎng)12小時(shí)，將小室置于4％多聚甲醛中固定20min，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，置于1‰結(jié)晶紫染色20-30min

11、，清水漂洗至少3次，吹干后用高倍顯微鏡(400×)隨機(jī)取上、下、左、右、中5個(gè)視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　 5)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的愈合能力
　　 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80％左右時(shí)，用200ul的槍頭在每孔中垂直劃“+”，并用PBS洗滌脫落細(xì)胞，分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的16ug/ml的順鉑或無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0h、12h、24h、36h時(shí)觀察并拍照

12、，計(jì)算愈合率。
　　 4、過(guò)表達(dá)PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞中端粒酶活性、Bcl-2和LRP表達(dá)的影響
　　 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細(xì)胞，采用Stretch PCR法檢測(cè)端粒酶相對(duì)活性，熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)Bcl-2和LRP表達(dá)情況，進(jìn)一步了解PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞化療增敏的分子機(jī)制。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

13、>　　 采用SPSS13.0軟件處理包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，參數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢測(cè)，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗(yàn)的Welch法。熒光定量PCR、Western Blotting、端粒酶活性檢測(cè)、小室實(shí)驗(yàn)及流式測(cè)細(xì)胞周期均采用One-WayANOVA方差分析，方差齊的用LSD法進(jìn)行多重比較，方差不齊的用Dunnett's T3法進(jìn)行多重比較。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)和劃痕實(shí)驗(yàn)均采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

14、P＜0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、重組慢病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 分別用雙酶切及測(cè)序鑒定了重組載體的正確，成功獲取了病毒液，病毒滴度為1.3×107IU/ml。
　　 2、重組慢病毒對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的感染及感染前后PinX1的表達(dá)變化
　　 慢病毒Lenti-PinX1和對(duì)照組慢病毒Lenti-Crtl感染鼻咽癌細(xì)胞48h時(shí)均可觀察到綠色熒光表達(dá)，對(duì)照組慢病毒Lenti-Cr

15、tl感染組熒光相對(duì)較強(qiáng)、較多，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，熒光量均增多、增強(qiáng)，當(dāng)感染后96h時(shí)熒光表達(dá)最多，未感染的細(xì)胞始終看不到熒光表達(dá);qRT-PCR和Western blotting均顯示Lenti-PinX1-5-8F細(xì)胞中PinX1基因較Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細(xì)胞中表達(dá)增多。
　　 3、PinX1基因聯(lián)合順鉑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響
　　 MTT檢測(cè)顯示PinX1、順鉑單用均能不同程度的抑制鼻咽癌細(xì)胞

16、的增殖，但兩者聯(lián)合的增殖抑制能力最為明顯，當(dāng)PinX1與8-32ug/ml濃度的順鉑聯(lián)合時(shí)均出現(xiàn)協(xié)同作用，尤其在16ug/ml濃度時(shí)，協(xié)同作用最大。可見(jiàn)，PinX1可以增加鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性;Hoechst33258染色進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)方面說(shuō)明PinX1和16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)核固縮、核碎裂等凋亡細(xì)胞更為明顯;流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，顯示PinX1與16ug/ml的順鉑聯(lián)合能更明顯的將細(xì)胞周期阻止在G0/G1期，減少細(xì)

17、胞的分裂增殖能力;小室試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)也證實(shí)PinX1與順鉑的聯(lián)合能顯著抑制細(xì)胞的遷移和愈合能力。
　　 4、PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞中端粒酶活性、抗凋亡基因Bcl-2和肺耐藥相關(guān)基因LRP的影響
　　 Stretch PCR對(duì)端粒酶相對(duì)活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Lenti-PinX1-5-8F細(xì)胞中端粒酶相對(duì)活性明顯低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細(xì)胞;qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，

18、Lenti-PinX1-5-8F中Bcl-2、LRP低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、PinX1基因聯(lián)合順鉑能增加對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞的化療敏感性，尤其是PinX1基因與16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)協(xié)同作用更強(qiáng)，說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用在增強(qiáng)化療療效的同時(shí)，還可以減少順鉑的用藥劑量，這對(duì)降低化療藥的全身毒副作用有意義。
　　 2、PinX1基因增加順鉑化療敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥作用有可能