內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在十溴聯(lián)苯醚誘導(dǎo)SerW3細(xì)胞系凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　體外研究十溴聯(lián)苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）暴露對(duì)小鼠睪丸支持細(xì)胞系（SerW3）的細(xì)胞凋亡損傷水平，初步討論BDE-209對(duì)SerW3細(xì)胞凋亡的影響和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，為研究BDE-209致SerW3細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞系（SerW3）之后暴露于BDE-209中，總共分為5個(gè)劑量組，分別為對(duì)照組（含有1％DMSO的培養(yǎng)基）

2、和劑量組（劑量分別為10μg/ml BDE-209、20μg/ml BDE-209、30μg/ml BDE-209、40μg/ml BDE-209）。染毒24h后，每組的細(xì)胞形態(tài)差異用倒置顯微鏡來(lái)觀察；MTT比色分析法檢測(cè)每組細(xì)胞存活率；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)；Annexin V/PI雙染法和Hoechst染色的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平；免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生中的caspase12、GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：

3、
　　倒置顯微鏡觀察各處理組的SerW3細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體為寬大的柱狀或不規(guī)則形狀，有多個(gè)突起，胞核為卵圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞鋪展成膜狀單層。染毒組中的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變形現(xiàn)象且細(xì)胞膜有發(fā)泡現(xiàn)象，隨著染毒劑量的增加，突起變短，細(xì)胞空泡增加。在20μg/ml BDE-209、30μg/ml BDE-209、40μg/ml BDE-209染毒組的細(xì)胞發(fā)生了明顯的空泡、皺縮，之后脫落，最后消失。MTT法檢測(cè)SerW3細(xì)

4、胞存活率的高低，不同染毒劑量作用24h后與對(duì)照組相比，染毒組細(xì)胞存活率有所下降，其中10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一劑量BDE-209染毒，時(shí)間劑量效應(yīng)結(jié)果，與對(duì)照組相比，各染毒時(shí)間下（8h、16h、20h、24h、48h）的細(xì)胞存活率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)SerW3細(xì)胞，不同劑量染毒24h與對(duì)照組相比，染毒劑量組細(xì)胞乳酸脫氫酶顯

5、著增加，表明隨著染毒劑量的增加，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性也逐漸增加，染毒劑量為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml組與對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果為 BDE-209染毒組（20μg/ml）與空白對(duì)照組比較，第二象限的早凋細(xì)胞和第三象限的晚凋細(xì)胞比例逐漸增加，第一象限的正常細(xì)胞比例反應(yīng)出了逐漸降低的趨勢(shì)。而B(niǎo)DE-209+4-PBA組與BDE-209染毒組

6、比較，第二象限的早凋細(xì)胞比例減少，第三象限的晚凋細(xì)胞比例也減少，而正常細(xì)胞的比例則逐漸增加，其分布在第一象限中。Hoechst染色結(jié)果中表現(xiàn)為對(duì)照組的細(xì)胞核位于胞體的一側(cè)，大小正常，呈不對(duì)稱分布，核仁清晰可見(jiàn)。而各劑量組中可以看出凋亡細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越多，各組細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞體積偏小，明亮染色且鮮艷的染色質(zhì)凝聚，固縮和破碎的細(xì)胞核明顯。免疫印跡結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較來(lái)說(shuō)，40μg/ml劑量組 caspase12蛋白表達(dá)增加，caspas

7、e12/β-actin之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。30μg/ml劑量組與40μg/ml劑量組的CHOP蛋白與對(duì)照組比較后，其表達(dá)增加，CHOP/β-actin之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。染毒劑量為30μg/ml組、40μg/ml組與對(duì)照組之間 GRP78蛋白表達(dá)增加，GRP78/β-actin之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　BDE-209染毒可以誘導(dǎo)SerW3細(xì)胞凋亡，并且會(huì)影響細(xì)

8、胞形態(tài)，降低細(xì)胞的存活率，并與染毒劑量呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑和BDE-209共處理后，凋亡細(xì)胞較BDE-209染毒組減少。
　　目的：
　　體外研究中已證實(shí)BDE-209誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞系（SerW3）凋亡，現(xiàn)體內(nèi)研究十溴聯(lián)苯醚對(duì)小鼠睪丸組織的凋亡情況。包括形態(tài)學(xué)電鏡觀察睪丸組織凋亡情況和Hoechst染色觀察組織凋亡情況。
　　方法
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將52只雄性ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一

9、周，隨機(jī)方式分為4組，即玉米油組、低劑量組（100 mg/kg BW）、中劑量組（300 mg/kg BW）和高劑量組（500 mg/kg BW），每組13只，經(jīng)灌胃途徑染毒處理6周后脫頸處死，冰浴情況下分離臟器、稱重，然后保存在-80℃。電鏡觀察睪丸組織凋亡情況和Hoechst染色觀察組織凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　用透射電子顯微鏡觀察到對(duì)照組睪丸生精上皮細(xì)胞排列規(guī)則，核膜清晰，核仁明顯，支持細(xì)胞胞體呈寬大的柱狀或不規(guī)則狀

10、，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體較多，細(xì)胞核呈卵圓形。低劑量組（100μg/ml BDE-209處理組）支持細(xì)胞超微改變不明顯，但能看到輕微核染色質(zhì)濃縮。中劑量組（300μg/ml BDE-209處理組）支持細(xì)胞數(shù)量減少，部分支持細(xì)胞線粒體空泡化、核染色質(zhì)邊集。而高劑量組（500μg/ml BDE-209處理組）變化明顯，部分受損嚴(yán)重的細(xì)胞可見(jiàn)核染色質(zhì)凝聚，核膜溶解，核碎裂等征象。Hoechst染色結(jié)果可看出對(duì)照組細(xì)胞核正常大小，位于胞體的一側(cè)，呈