vWF A3-GPI強(qiáng)化EPCs富集及其在損傷血管壁修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 血管內(nèi)膜損傷后內(nèi)皮修復(fù)主要依靠損傷血管內(nèi)膜邊緣的內(nèi)皮細(xì)胞及循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)。損傷局部邊緣內(nèi)皮增生、遷移形成的再生內(nèi)皮常存在表型改變和/或功能紊亂，不能發(fā)揮正常內(nèi)皮功能；而EPCs在微環(huán)境中能成為適宜局部生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，并行使內(nèi)皮細(xì)胞功能。因此，EPCs移植成為治療血管損傷最有前景的方法之一。但由于缺乏特異性引導(dǎo)信號(hào)，EPCs在損傷處富集率低下往往導(dǎo)致

2、移植效率不高。如能找到引導(dǎo)EPCs特異富集至受損血管內(nèi)膜的相關(guān)分子，則可大大提高細(xì)胞移植效率。眾所周知，血管損傷后血小板可特異黏附至損傷血管壁。如通過(guò)某種技術(shù)將血小板的特異黏附能力賦予EPCs，則可能解決此問(wèn)題。 介導(dǎo)血小板黏附至損傷血管壁最重要的分子是血管性假血友病因子(vWF)。vWF的A3區(qū)(vWFA3)是與內(nèi)皮下膠原特異結(jié)合的關(guān)鍵部位。血管受損時(shí)，A3首先與暴露的內(nèi)皮下膠原結(jié)合，再通過(guò)A1黏附血小板，從而介導(dǎo)血小板特異黏

3、附受損血管壁。如果使移植EPCs攜帶vWFA3，則有可能使EPCs具有類似于血小板特異性黏附受損血管壁的能力。 基因轉(zhuǎn)染可使EPCs表達(dá)vWFA3，但如何才能控制其表達(dá)于細(xì)胞表面，而非細(xì)胞內(nèi)呢?新興的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)為該問(wèn)題的解決提供了策略。該技術(shù)利用基因工程手段將糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)與目的蛋白質(zhì)融合表達(dá)，獲得的目的蛋白能夠通過(guò)其GPI結(jié)構(gòu)錨定于細(xì)胞膜表面，而不跨越

4、磷脂膜雙層結(jié)構(gòu)。應(yīng)用此技術(shù)可能獲得表面攜帶vWFA3的EPCs細(xì)胞，促進(jìn)EPCs向血管內(nèi)膜損傷局部富集。 研究目的： 獲得具有能與損傷血管壁內(nèi)膜下膠原特異結(jié)合的新型引導(dǎo)分子的EPCs，檢測(cè)其是否具有向損傷血管局部富集及促損傷血管修復(fù)的效應(yīng)，為探索血管內(nèi)膜損傷修復(fù)提供新思路。 研究方法： 1.構(gòu)建含GPI結(jié)構(gòu)的vWFA3融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)RT-PCR方法分別獲得血管性假血友病因子A3區(qū)(vWFA3)及

5、GPI信號(hào)肽編碼序列，通過(guò)PCR方法將FLAG標(biāo)簽加入GPI編碼序列上游；通過(guò)酶切連接，將vWFA3編碼基因和GPI編碼基因同時(shí)插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)中。 2.重組蛋白vWFA3-GPI的表達(dá)與純化應(yīng)用脂質(zhì)體將pcDNA3.1(-)-vWFA3-GPI轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，G418篩選。以熒光抗體流式細(xì)胞術(shù)(FCM)挑取陽(yáng)性克隆。細(xì)胞爬片，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察。磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)處理，F(xiàn)CM

6、檢測(cè)處理前后細(xì)胞表面融合蛋白變化。用免疫親和層析方法純化表達(dá)蛋白，SDS-PAGE和Westernblot分析鑒定。 3.重組蛋白vWFA3-GPI的生物活性分析采用ELISA分析重組蛋白vWFA3-GPI與膠原的結(jié)合活性，采用FCM分析vWFA3-GPI對(duì)EPCs細(xì)胞膜的錨定作用，采用CCK8法分析vWFA3-GPI修飾后EPCs增殖活性的變化及其膠原結(jié)合能力。 4.定量分析移植EPCs/vWFA3在頸動(dòng)脈損傷模型動(dòng)物

7、體內(nèi)的分布聯(lián)合使用3H-TdR標(biāo)記或GFP標(biāo)記方法檢測(cè)移植EPCs在頸動(dòng)脈損傷模型動(dòng)物體內(nèi)的分布，了解vWFA3錨定修飾EPCs是否可以促進(jìn)移植EPCs向血管損傷部位優(yōu)勢(shì)分布。 5.促血管修復(fù)效應(yīng)檢測(cè)EvansBlue染色觀察損傷動(dòng)脈再內(nèi)皮化情況，HE染色測(cè)定新生內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積、原始管腔和狹窄管腔面積、狹窄百分面積等。 研究結(jié)果： 1.瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或人臍血單個(gè)核細(xì)胞

8、總RNA的RT-PCR產(chǎn)物分別有670bp或150bp的熒光條帶。 2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-vWFA3-GPI酶切分析提示插入片段約820bp；測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示序列完全正確，且引入了FLAG標(biāo)簽，可用于下一步的表達(dá)、純化實(shí)驗(yàn)。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選到一株高表達(dá)克隆(陽(yáng)性率99.95％，熒光強(qiáng)度為189.41)，PI-PLC處理后其陽(yáng)性率降為5.7％，熒光強(qiáng)度為31.99

9、；Westernblot結(jié)果顯示該融合蛋白分子量為60KD；免疫熒光激光共聚焦顯微鏡顯示該融合蛋白主要定位在細(xì)胞膜；SDS-PAGE凝膠電泳顯示，抗FLAG抗體親和層析柱層析產(chǎn)物中，有一條分子量約60KD的單一條帶，Westerrnblot顯示為帶FLAG標(biāo)簽的融合蛋白。 4.根據(jù)ELISA測(cè)定選擇重組蛋白最佳孵育時(shí)間為2h，最佳孵育濃度為400ng/ml，錨定EPCs后12h，其陽(yáng)性率仍為89％以上，錨定后能被PI-PLC水解

10、，可按比例結(jié)合膠原。 5.EPCs被錨定后，增殖活性無(wú)明顯變化；輸入頸動(dòng)脈損傷模型體內(nèi)，再內(nèi)皮化率由對(duì)照組的20.3±2.1％增至85.7±5.1％，分布至損傷血管細(xì)胞鼠與正常血管的比值則由對(duì)照組的3.63±0.10增至28.57±0.89，具有顯著性差異；熒光顯微鏡觀察到損傷血管內(nèi)膜處有表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，新生內(nèi)膜增生程度由對(duì)照組的75±19.3％降為21±3.6％。 研究結(jié)論： 1.通過(guò)RT-PCR技術(shù)，

11、可從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取RNA中成功克隆出人vWFA3基因，從人臍血單個(gè)核細(xì)胞提取RNA中成功克隆出GPI錨定信號(hào)肽基因；通過(guò)基因重組技術(shù)能構(gòu)建vWFA3與GPI融合基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-vWFA3-GPI，并引入FLAG標(biāo)簽。 2.構(gòu)建的融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后能得到有效表達(dá)，分子量約為60KD；融合蛋白主要以細(xì)胞膜錨定形式表達(dá)；表達(dá)有融合蛋白vWFA3-GPI的CHO細(xì)胞具有膠原結(jié)合活性；通過(guò)抗F

12、LAG親和層析，可以獲得純化的融合蛋白vWFA3-GPI。 3.用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染法，可以使EPCs細(xì)胞膜表面攜帶vWFA3-GPI，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；同時(shí)保持其膠原結(jié)合能力。 4.移植EPCs能歸巢于血管損傷部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，抑制新生內(nèi)膜增生；vWFA3-GPI錨定修飾能提高EPCs向損傷血管壁富集比例，增強(qiáng)移植EPCs防治血管狹窄效應(yīng)。 5.本研究借用血小板能特異黏附受損血管壁的特點(diǎn)，提出了用蛋白轉(zhuǎn)染法制備引