血友病A患者血漿因子Ⅷ抑制物檢測(cè)及其發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、血友病A（hemophilia A，HA）是由于遺傳性凝血因子Ⅷ基因缺陷，造成血漿因子Ⅷ含量不足或功能缺陷而引起的一組終身出血的凝血障礙性疾病，屬X性聯(lián)染色體隱性遺傳性疾病。因子Ⅷ制品替代治療已使血友病致殘率與死亡率均大大降低。近年來(lái)，隨著血友病綜合防治措施的倡導(dǎo)和推廣，在準(zhǔn)確診斷和及時(shí)防治同時(shí)，十分強(qiáng)調(diào)對(duì)所有血友病A患者監(jiān)測(cè)因替代治療而產(chǎn)生的因子Ⅷ抑制物。伴因子Ⅷ抑制物的血友病A患者更易發(fā)生出血，且常規(guī)替代治療難以奏效，嚴(yán)重威脅患者生

2、命。血友病A患者接受含有因子Ⅷ制品替代治療后可產(chǎn)生特異性抑制因子Ⅷ促凝活性的同種抗體。這類同種抗體有較大的異質(zhì)性，一部分可通過(guò)與因子Ⅷ功能區(qū)的相互作用而抑制或滅活因子Ⅷ促凝活性，稱為因子Ⅷ抑制物，臨床上可通過(guò)Bethesda方法或改良的Nijmegen方法檢測(cè)；而另一部分因子Ⅷ同種抗體與因子Ⅷ抗原表位結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，使因子Ⅷ過(guò)早地從循環(huán)中被清除，導(dǎo)致自體或輸入的因子Ⅷ半衰期明顯縮短，影響治療效果，而此類抗體不能被常規(guī)方法檢測(cè)到

3、。本研究將探討血友病A患者因子Ⅷ抑制物產(chǎn)生的相關(guān)因素，腫瘤壞死因子（TNF-α）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA-4）基因多態(tài)性與血友病A患者產(chǎn)生因子Ⅷ抑制物的相關(guān)性，通過(guò)自行建立的ELISA方法，檢測(cè)了140例血友病A患者血漿抗因子Ⅷ同種抗體，以了解經(jīng)過(guò)替代治療的血友病A患者血漿抑制物的發(fā)生率，指導(dǎo)臨床治療，并分析因子Ⅷ同種抗體與因子ⅧC區(qū)的相互作用。
　　 1.血友病A患者因子Ⅷ抑制物發(fā)生的相關(guān)因素分析。
　　

4、 回顧性分析113例血友病A患者的臨床資料及治療情況。對(duì)其中85例經(jīng)過(guò)因子Ⅷ替代治療的患者進(jìn)行因子Ⅷ抑制物檢測(cè)，并分析因子Ⅷ抑制物發(fā)生的相關(guān)因素。重型74例，中型27例，輕型12例。本組經(jīng)因子Ⅷ替代治療的血友病A患者因子Ⅷ抑制物的發(fā)生率為28.24％，均為低滴度抑制物，均發(fā)生在中重型患者。首次使用因子Ⅷ持續(xù)時(shí)間、血友病患者嚴(yán)重程度、是否有大出血或手術(shù)大量使用因子Ⅷ史均與因子Ⅷ抑制物是否發(fā)生相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血友病A患者

5、血漿抑制物發(fā)病率并不低，以低滴度抑制物為主，多發(fā)生在中、重型患者。首次使用因子Ⅷ持續(xù)時(shí)間超過(guò)5天、中重型血友病患者、有大出血或手術(shù)大量使用因子Ⅷ史均與因子Ⅷ抑制物發(fā)生相關(guān)。
　　 2.腫瘤壞死因子（TNF-α）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA-4）基因多態(tài)性與中國(guó)漢族血友病A患者因子Ⅷ抑制物發(fā)生的相關(guān)研究。
　　 采用聚合酶鏈反應(yīng)，限制性內(nèi)切酶消化及電泳技術(shù)，對(duì)140例HA患者和108例正常對(duì)照者的TNF-α及CT

6、LA-4基因的單堿基突變多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，所有HA患者樣本均應(yīng)用改良的Nijmegen方法檢測(cè)抑制物滴度。在HA患者中，TNF-α-308G/G基因型有118例（84.3％），G/A基因型有18例（12.8％），A/A基因型有4例（2.9％）；在正常對(duì)照者中，G/G基因型有92例（85.2％），G/A基因型有11例（10.2％），A/A基因型有5例（4.6％）。TNF-α-308基因型頻率在HA病例組與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.

7、05）。在HA患者中，C/C基因型有108例（77.2％），C/T基因型有30例（21.4％），T/T基因型有2例（1.4％）；在正常對(duì)照者中，C/C基因型有81例（75％），C/T基因型有25例（23.1％），T/T基因型有2例（1.9％）。CTLA-4基因型頻率在HA病例組與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。改良的Nijmegen方法檢測(cè)抑制物滴度結(jié)果顯示，34例（24.3％）HA患者抑制物陽(yáng)性，均為低滴度抑制物。關(guān)聯(lián)分析

8、顯示A等位基因攜帶HA患者發(fā)生因子Ⅷ抑制物的風(fēng)險(xiǎn)是非A等位基因攜帶患者的7.519倍（OR=7.519，95％CI=3.168～17.844）；A等位基因攜帶重型HA患者發(fā)生因子Ⅷ抑制物的風(fēng)險(xiǎn)是非A等位基因攜帶重型患者的8.163倍（OR=8.163，95％CI=2.521～26.434）。TNF-α-308基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群重型HA患者發(fā)生因子Ⅷ抑制物具有相關(guān)性，該基因可能為HA患者替代治療產(chǎn)生抑制物的調(diào)節(jié)基因之一。
　　

9、 3.血友病A患者血漿抗因子Ⅷ同種抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及因子Ⅷ同種抗體與因子ⅧC區(qū)的相互作用。
　　 血友病A患者樣本140例，其中重型84例，中型34例，輕型22例；正常對(duì)照樣本80例。以本室制備的抗因子Ⅷ單克隆抗體包被酶標(biāo)板，4℃濕盒過(guò)夜；經(jīng)3％BSA-TBS封閉后，加入重組人凝血因子Ⅷ，室溫2小時(shí)；待測(cè)血漿樣本經(jīng)稀釋后每孔加入100μl，室溫2小時(shí)；充分洗滌后，加入稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG，室溫2小時(shí)；OP

10、D顯色，記錄A490。以正常人血漿為對(duì)照，樣本A490大于正常人對(duì)照3 SD定義為因子Ⅷ抗體陽(yáng)性。所有患者血漿樣本應(yīng)用改良的Nijmegen方法檢測(cè)抑制物活性。通過(guò)ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，56例（40％）抗體陽(yáng)性；改良的Nijmegen方法檢測(cè)抑制物活性結(jié)果顯示，34例（24.3％）抑制物陽(yáng)性，均為低滴度抑制物。其中，25例通過(guò)ELISA法檢測(cè)出同種抗體陽(yáng)性的患者未被檢出抑制物活性。為了研究抗因子Ⅷ同種抗體與因子Ⅷ的C區(qū)的相互作用，以

11、抗His抗體包被酶標(biāo)板，封閉后加入本室制備的rFⅧ-C1C2區(qū)蛋白，洗滌后加入待測(cè)稀釋血漿，再次洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG，OPD顯色，記錄A490。以正常人血漿為對(duì)照，樣本A490大于正常人對(duì)照3 SD定義陽(yáng)性，通過(guò)ELISA法檢測(cè)，82.1％（46/56）血友病A患者血漿抗因子同種抗體與因子Ⅷ的C區(qū)結(jié)合。中國(guó)漢族人血友病A患者血漿抑制物發(fā)病率并不低，以低滴度抑制物為主。ELISA法是一種快速而敏感的篩選血友病A患者血漿抗因子