Gax基因抑制血管的周圍脂肪細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的:
　　 采用Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建攜帶Gax基因的重組腺病毒載體并觀察其在小鼠血管周圍脂肪細(xì)胞中的表達(dá)，探討其對(duì)血管周圍脂肪細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 方法:
　　 1、含有Gax基因腺病毒載體構(gòu)建:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增小鼠Gax基因，將腺病毒載體與Gax基因組成pAd-Gax質(zhì)粒。用293細(xì)胞包裝產(chǎn)生的重組腺病毒Ad-Gax。純化和濃縮Ad-Gax。
　　 2、貼壁法培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞(3T3-L1)，細(xì)胞

2、長(zhǎng)到80％時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)采用2-6代細(xì)胞。
　　 3、貼壁法培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，使細(xì)胞長(zhǎng)到100％，然后用誘導(dǎo)劑IBMX、胰島素、地塞米松進(jìn)行誘導(dǎo)分化，大約8天后長(zhǎng)成脂肪細(xì)胞，用油紅(0)染色鑒定。
　　 4、將誘導(dǎo)分化成功的脂肪細(xì)胞隨機(jī)分成攜有綠色熒光蛋白的腺病毒組(Ad-GFP組)，攜有綠色熒光蛋白的腺病毒加IGF-1組（Ad-GFP+IGF-1組），Gax腺病毒加IGF-1組(Ad-Gax+IGF-1組)，Gax腺

3、病毒組(Ad-Gax組)，IGF-1組，正常細(xì)胞組（PBS組）。IGF-1在培養(yǎng)基中的最終濃度為80ng/ml。
　　 5、轉(zhuǎn)染和GFP檢測(cè):將培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基吸走，用PBS小心沖洗脂肪細(xì)胞，將用Opti-MEM制備的病毒液加入六孔板中。Ad-Gax和Ad-GFP的MOI值均為100，37℃孵育5-6小時(shí)候加入普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，過夜后換成普通培養(yǎng)基然后分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72小時(shí)，按照以下兩種方法進(jìn)行觀察。脂肪細(xì)胞

4、的轉(zhuǎn)染效率用GFP來測(cè)定。
　　 6、蛋白印跡分析(WB):觀察Ad-Gax和IGF-1干預(yù)后，ERK2通道蛋白的表達(dá)情況。
　　 7、RT-PCR:觀察Ad-Gax和IGF-1干預(yù)后，ERK2通道蛋白R(shí)NA的表達(dá)情況。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1、經(jīng)PCR測(cè)序證實(shí)目的基因Gax片段正確重組入目的病毒載體中。Westernblot結(jié)果證實(shí)Gax腺病毒高效表達(dá)載體構(gòu)

5、建成功，測(cè)得成熟的病毒顆粒滴度為1.6×1011pfu/ml。
　　 2、在前脂肪細(xì)胞接觸抑制以后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)后第三天出現(xiàn)脂滴，第八天誘導(dǎo)分化率達(dá)到80％以上，油紅(0)染色鑒定為脂肪細(xì)胞。
　　 3、分別在重組Gax腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠脂肪細(xì)胞24h、48h、72h及7天后觀察轉(zhuǎn)染效率，其中72h時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，約為80％-90％;轉(zhuǎn)染至第7天時(shí)，脂肪細(xì)胞基本完全死亡。
　　 4、Western-blot結(jié)果

6、:與Opti-MEM組及Ad-GFP組相比，轉(zhuǎn)染Ad-Gax的脂肪細(xì)胞在72h的增殖明顯降低（P＜0.05）;Ad-GFP組較Opti-MEM組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);Ad-Gax+IGF-1組較Ad-Gax組增殖明顯增高(p＜0.05)。
　　 5、RT-PCR結(jié)果:與Opti-MEM組及Ad-GFP組相比，轉(zhuǎn)染Ad-Gax的脂肪細(xì)胞在72h的通道蛋白mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）;Ad-GFP組較Opti-M

7、EM組mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）;Ad-Gax+IGF-1組較Ad-Gax組mRNA表達(dá)水平明顯增高(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用Adxsi系統(tǒng)成功構(gòu)建了小鼠Gax腺病毒載體。該方法與傳統(tǒng)構(gòu)建技術(shù)相比具有高效性，簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Gax基因的生物學(xué)特性和利用Gax基因進(jìn)行基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)獲得脂肪細(xì)胞，較取