ER非基因組活性上調(diào)乳腺癌FEN1基因表達(dá)及Herceptin治療抵抗作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：ER是核受體的超家族成員之一，它在乳腺正常發(fā)育及乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中有重要調(diào)節(jié)作用。乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展與雌激素(E2)和雌激素受體(ER)密切相關(guān)。在細(xì)胞核中的ER可以直接與靶基因啟動子區(qū)的雌激素反應(yīng)元件(ERE)結(jié)合并且通過募集一些輔調(diào)節(jié)蛋白(包括核受體輔激活蛋白和輔阻遏蛋白)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，這就是通常所指的ER基因組活性(ER genomic activity)。此外，近期的研究顯示，位于胞膜和胞漿的ER還可以介導(dǎo)快速的非基

2、因組活性(ER non-genomic activity)。該活性和HER2途徑之間可進(jìn)行廣泛的“串話(Cross-talk)”或相互作用，活化的其下游信號分子MAPK和Akt，其結(jié)果使包括HER2途徑相關(guān)基因在內(nèi)的眾多基因的表達(dá)被增強(qiáng)，這些基因產(chǎn)物，反過來進(jìn)一步加強(qiáng)HER2途徑，導(dǎo)致細(xì)胞不依賴于E2的生長，使針對E2和ER的內(nèi)分泌治療出現(xiàn)抵抗。因此，ER非基因組活性被認(rèn)為是導(dǎo)致乳腺癌內(nèi)分泌治療抵抗非常重要的機(jī)制。此外，ER的非基因組活

3、性參與了乳腺癌眾多的基因調(diào)控，例如，E2通過ER非基因組活性快速激活SphK1(鞘氨醇激酶)，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖，遷移和血管的發(fā)生。E2可以通過非基因組活性增加Ca2+依賴的K+通道傳導(dǎo)力活性，從而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖。
　　 瓣狀核酸內(nèi)切酶(FEN1)是近期發(fā)現(xiàn)與ER介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)也密切相關(guān)的輔調(diào)節(jié)蛋白成員之一。最近研究顯示，F(xiàn)EN1基因與乳腺癌的發(fā)生也有密切相關(guān)性。與相應(yīng)正常乳腺組織相比，F(xiàn)EN1在乳腺癌中

4、過度表達(dá)。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)FEN1在乳腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)受E2的調(diào)節(jié)，并增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞增殖，但FEN1的表達(dá)受E2上調(diào)的信號機(jī)制尚未闡明。我們的生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1基因啟動子區(qū)沒有ER的直接結(jié)合位點(diǎn)，但是有4個潛在的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1結(jié)合位點(diǎn)，我們則推測：E2上調(diào)FEN1基因的表達(dá)也許不是通過經(jīng)典的調(diào)節(jié)方式，即ER直接結(jié)合到FEN1的基因啟動子區(qū)(基因組活性)而是通過位于胞膜或者胞漿的ER介導(dǎo)的非基因組活性實(shí)現(xiàn)的；結(jié)合前期的

5、實(shí)驗結(jié)果，E2上調(diào)MCF-7乳腺癌細(xì)胞中FEN1啟動子的活性依賴于細(xì)胞中全長的Elk-1，因此，我們推測E2可能是通過ER-MAPK-Elk-1這種快速非基因組途徑上調(diào)了FEN1的表達(dá)。
　　 Herceptin/Trastuzumab(中文商品名“赫賽汀”)是針對HER2的人源化單克隆抗體，能有效抑制HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的生長和增殖，但臨床Herceptin抵抗十分常見。目前產(chǎn)生Herceptin抵抗的確切機(jī)制尚不完全清

6、楚。鑒于①作為Herceptin治療靶點(diǎn)的HER2途徑，由于可被位于胞膜或胞漿的ER通過非基因組活性激活，勢必增加Herceptin的有效抑制劑量，從而減弱Herceptin的治療效果。②已有研究報道，在其他ER陽性的非乳腺癌細(xì)胞中，位于胞膜或胞漿的ER還可通過非基因組活性直接與IGF-1R和PI3K/Akt相互作用，從而激活I(lǐng)GF-1R和Akt；而Akt和IGF-1R的激活，根據(jù)報道本身就是導(dǎo)致Herceptin抵抗的表型產(chǎn)生的機(jī)制之

7、一。這些證據(jù)均支持ER非基因組活性在ER陽性乳腺癌細(xì)胞Herceptin治療抵抗中可能發(fā)揮了潛在的作用。
　　 研究內(nèi)容：(1)采用RT-PCR、Western blot、EMSA、ChIP分析等技術(shù)研究E2通過ER-MAPK-Elk-1途徑上調(diào)乳腺癌組織中FEN1基因表達(dá)的信號機(jī)制。(2)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染分析、RT-PCR、Western blot、免疫熒光結(jié)合激光共聚焦分析和CoIP等技術(shù)研究ER非基因組活性對ER陽性乳腺癌細(xì)胞

8、Herceptin療效的影響及機(jī)制。
　　 研究結(jié)果：
　　 (一)ER非基因組活性上調(diào)乳腺癌FEN1基因表達(dá)機(jī)制研究：
　　 (1)E2可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中FEN1表達(dá)。
　　 (2)E2可以通過非基因組活性激活MAPK和Elk的磷酸化。
　　 (3)E2對FEN1表達(dá)的上調(diào)作用是通過Elk-1結(jié)合到FEN1啟動子的SRE位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)的。
　　 (4)乳腺癌中ER和FEN1以及磷酸化MAP

9、K和Elk-1的表達(dá)均高于癌旁組織，在臨床樣本中進(jìn)一步證實(shí)E2上調(diào)FEN1是通過ER-MAPK-Elk-1這一非基因組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 (二)ER非基因組活性在Hereceptin治療抵抗中的作用以及機(jī)制研究：
　　 (1)E2和生長因子Heregulin都可以快速上調(diào)磷酸化MAPK和AKT的表達(dá)。
　　 (2)Herceptin可以抑制Heregulin誘導(dǎo)的MAPK和AKT磷酸化。
　　 (

10、3)E2能干擾Herceptin抑制Heregulin誘導(dǎo)的MAPK和AKT磷酸化的作用
　　 (4)ER與IGF-1R存在相互作用并且定位于胞漿或胞膜，表明IGF-1R可能也能被E2通過ER非基因組活性快速激活。
　　 結(jié)論：(1)E2可通過ER非基因組活性，即ER-MAPK-Elk-1途徑上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中FEN1的表達(dá)。(2)E2能通過ER基因組活性干擾ER陽性乳腺癌的Herceptin抑制效應(yīng)。
　　 研究

11、目的和意義：(1)本研究為E2上調(diào)FEN1的表達(dá)提供了一個全新的信號機(jī)制，可解釋臨床觀察到的乳腺癌組織過表達(dá)FEN1的原因。同時，結(jié)合前期的研究結(jié)果，可確定FEN1作為乳腺癌患者進(jìn)程的潛在標(biāo)志物的作用，闡明同樣作為乳腺癌標(biāo)志物的E2、ER與FEN1在影響乳腺癌進(jìn)程中的相互關(guān)系。加深對FEN1基因表達(dá)調(diào)控和乳腺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，并為臨床尋找增強(qiáng)乳腺癌化療敏感性的新措施提供理論依據(jù)。(2)闡明E2可通過ER非基因組活性干擾ER陽性乳腺癌細(xì)胞