人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在新型神經(jīng)支架內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)的初步研究.pdf

1、目的：近年來，脊髓損傷(SCI)在我國的發(fā)病率越來越高，究其原因與交通、建筑等行業(yè)高速發(fā)展不無關(guān)系。其高致殘率給社會(huì)與個(gè)人帶來沉重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)，尤其是脊髓橫斷性損傷，神經(jīng)功能的恢復(fù)幾乎無望。如何使離斷的脊髓得到有效連接，使受損的神經(jīng)元功能得到恢復(fù)是醫(yī)學(xué)界急需解決的難題。隨著組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，一種更先進(jìn)的SCI修復(fù)理念逐步形成，即對(duì)SCI的有效治療必須重建軸突與靶細(xì)胞間的連接才有根本意義，而組織工程支架植入或許是最有可能達(dá)到這一理

2、想要求的有效途徑。為此，擬應(yīng)用幼年家犬脊髓經(jīng)化學(xué)萃取方法制作的一種新型神經(jīng)生物支架，觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)被注入到此支架內(nèi)的生長(zhǎng)情況，為該支架聯(lián)合人臍帶MSCs移植在完全橫貫性脊髓損傷動(dòng)物模型及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、神經(jīng)生物支架的制備：切取幼犬胸段脊髓長(zhǎng)約5cm，浸入40ml/LTritonX-100的蒸餾水溶液在4℃冰箱中過夜；蒸餾水浸浴3h后放入40mM/L脫氧膽酸鈉蒸餾水溶液中，置4℃冰

3、箱12h。以上步驟共重復(fù)3次。萃取后的脊髓支架置4℃冰箱備用。 2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，以PBS充分沖洗，剔除臍帶動(dòng)、靜脈，將其余的臍帶間質(zhì)組織切割成直徑約1mm大小的組織塊，在含有20％的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的高糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)5-7天后，顯微鏡下可見大量細(xì)胞自組織塊中游出，向外呈放射狀貼壁生長(zhǎng)。

4、待細(xì)胞達(dá)到80％-90％匯合后，加入0.2％胰酶消化傳代。收集第三代人臍帶MSCs行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原證實(shí)其為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后凍存?zhèn)溆谩?3、凍存的人臍帶MSCs復(fù)蘇與神經(jīng)生物支架相容性研究：對(duì)凍存的人臍帶MSCs復(fù)蘇使細(xì)胞密度達(dá)到1×106/ml，用微量注射器分點(diǎn)注入支架內(nèi)，置入含有BDNF、bFGF、NGF的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為48、72、96小時(shí)，應(yīng)用冰凍切片及Hitachi掃描、透射電鏡觀察人臍