臍血單核細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)及移植治療成年鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：
　　 脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervesystem，CNS)損傷性疾病，目前尚缺乏有效的治療措施。
　　 近年來(lái)，隨著神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的進(jìn)展，干細(xì)胞移植逐漸成為一種治療SCI的新方法。臍血單核細(xì)胞(umbilicalcordblood-mononuclearcells,UCB-MNCs)是一種多潛能干細(xì)胞，集成了多種臍血干細(xì)胞成

2、份，其內(nèi)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilicalcordblood-mesenchymalstemcells，UCB-MSCs）是一種多潛能干細(xì)胞，具有多向分化性，尤其是神經(jīng)分化特性。然而，臍血中的UCB-MSCs含量較少;傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)方法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基中加入血清，有傳染人類(lèi)的隱患。為避免上述不足，需要對(duì)UCB-MNCs進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。
　　 為便于模擬損傷具體情況和病理生理狀態(tài)，科學(xué)地評(píng)價(jià)相關(guān)的治療策略，國(guó)內(nèi)外相繼建立了一

3、些脊髓損傷模型，半橫斷塊狀缺損模型是目前常見(jiàn)的一種，然而，原模型制作方法在人為誤差，健側(cè)的損傷等問(wèn)題。
　　 本研究通過(guò):
　　 ①改進(jìn)大鼠脊髓半橫斷塊狀缺損模型;
　　 ②優(yōu)化臍血單核細(xì)胞的培養(yǎng)方法;
　　 ③優(yōu)化培養(yǎng)的臍血單核細(xì)胞損傷脊髓移植。
　　 進(jìn)而研究:
　　 ①改進(jìn)后半橫斷塊狀缺損模型的特點(diǎn)及病理變化;
　　 ②優(yōu)化后臍血單核細(xì)胞的生物學(xué)特性及其神經(jīng)分化;
　　

4、 ③優(yōu)化培養(yǎng)的臍血單核細(xì)胞對(duì)損傷脊髓的修復(fù)作用。
　　 方法：
　　 1、大鼠脊髓半橫斷塊狀缺損模型的改進(jìn):自制半橫斷刀。選成年SD大鼠，分組制造半橫斷塊狀缺損模型，A組用自制半橫斷刀改進(jìn)方法制作模型，B組用11號(hào)刀片制作模型。術(shù)后觀察各組的并發(fā)癥和Basso，Beattie，BresnahanScale(BBBScale)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，A組傷后6h、3d、7d、28d、56dHE及尼氏染色，觀察損傷邊緣組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)

5、元形態(tài)學(xué)變化。傷后6h、3d、7d、28d、56d檢測(cè)損傷段脊髓GFAP表達(dá)。
　　 2、臍血單核細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)及神經(jīng)分化的實(shí)驗(yàn)研究:首先采用正交實(shí)驗(yàn)方法篩選影響UCB-MNCs培養(yǎng)的各因素，優(yōu)化培養(yǎng)條件。設(shè)立優(yōu)化組:培養(yǎng)瓶LN包被，UCB-MNCs以1.0×106L-1的密度接種于含10ng/mLG-CSF、50ng/mLSCF、20ug/LbFGF、20ml/LB27低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)照組:UCB-MNCs以1.0

6、×106L-1接種于含20ng/mlbFGF、體積分?jǐn)?shù)為0.10FBS低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其后檢測(cè)各組培養(yǎng)成功率、細(xì)胞貼壁、增殖及形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞儀對(duì)各組行免疫表型分析;各組取1、2、3代細(xì)胞，免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Nestin、NSE表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)Nestin、NF、NSE、CDK5、SYNⅠ、p27kip-1基因轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　 3、臍血單核細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓半橫斷損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究:BrdU標(biāo)記臍血單核細(xì)

7、胞。制作大鼠脊髓半橫斷損傷模型，成功后即進(jìn)行分組并移植，試驗(yàn)組將5ul優(yōu)化培養(yǎng)的UCB-MNCs(1×105cells/μl)懸液移植到缺損處明膠海綿中;對(duì)照組將5ul傳統(tǒng)培養(yǎng)方式培養(yǎng)的UCB-MNCs移植到缺損處明膠海綿中。術(shù)后觀察大鼠的一般情況，BBB評(píng)分進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)，9周時(shí)處死并取標(biāo)本觀察大體標(biāo)本、移植細(xì)胞存活及形態(tài)變化，檢測(cè)免疫組化NF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、用自制半橫斷刀可以成功建立大鼠脊髓半橫斷

8、塊狀缺損模型，A、B組損傷側(cè)后肢的神經(jīng)功能缺損無(wú)顯著性差異，但損傷對(duì)側(cè)后肢神經(jīng)功能缺損有顯著差異，A組神經(jīng)功能一過(guò)性缺失，14天后恢復(fù)正常，B組35天后功能穩(wěn)定且殘留神經(jīng)功能缺損。大鼠脊髓半橫斷損傷后出現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)變化，
　　 2、篩選后優(yōu)化培養(yǎng)條件為:低糖DMEM培養(yǎng)基中含20ug/mlbFGF、50ng/mlSCF、10ng/mlG-CSF，并且培養(yǎng)瓶用LN包被的情況下，原代培養(yǎng)的細(xì)胞密度最高。優(yōu)化組細(xì)胞增殖優(yōu)于對(duì)照組(P

9、=0.00)、P3代UCB-MNCs中MSCs含量?jī)?yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。免疫組化:優(yōu)化組1、2、3代細(xì)胞Nestin表達(dá)逐漸降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組Nestin表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05);優(yōu)化組2、3代細(xì)胞的NSE表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。RT-PCR:優(yōu)化組P3代NFmRNA表達(dá)較P1代上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。優(yōu)化組、對(duì)照組P3代CDK5mRNA表達(dá)均較P1代明顯上調(diào)（P＜0.

10、05）;優(yōu)化組P1代p27kip1mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低且有明顯差異(P＜0.05)，優(yōu)化組p27kip1mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)，對(duì)照組p27kip1mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.05）;優(yōu)化組P3代SYNⅠmRNA表達(dá)較P1代明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組P1、P3代SYNⅠmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3、損傷后第1天，對(duì)照組患肢評(píng)分為0分，之后逐漸增加為9.64±0.73。實(shí)

11、驗(yàn)組損傷后第1天患肢評(píng)分為0分，之后逐漸增加，相對(duì)于對(duì)照組，從第5周開(kāi)始即有明顯的改善（P＜0.05）。術(shù)后9周，兩組塊狀缺損處均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組塊狀缺損區(qū)域均有NF的表達(dá)，試驗(yàn)組NF的表達(dá)明顯均優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組NF陽(yáng)性表達(dá)纖維呈束狀，而對(duì)照組NF陽(yáng)性表達(dá)纖維呈點(diǎn)狀。
　　 結(jié)論：
　　 1、用自制的半橫斷刀可以成功建立制作簡(jiǎn)單、重復(fù)性良好、神經(jīng)組織缺損規(guī)

12、范一致的脊髓半橫斷塊狀缺損模型。
　　 2、采用正交試驗(yàn)的方法可以篩選出臍血單核細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)瓶用LN包被，含20ug/mlbFGF、50ng/mlSCF、10ng/mlG-CSF的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 3、細(xì)胞因子加LN的方法誘導(dǎo)UCB-MNCs，可以使UCB-MNCs向較成熟神經(jīng)細(xì)胞分化。
　　 4、優(yōu)化培養(yǎng)的UCB-MNCs體內(nèi)移植有分化的方向性，較傳統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞利用效率高;可以整合到