醋酸菌pde基因?qū)δ苄允称?納塔合成影響研究.pdf

1、納塔，也稱細(xì)菌纖維素(Bacterialcellulose，BC)，是由微生物產(chǎn)生的一類純纖維素。它是由β-D-葡萄糖通過β-1,4-葡萄糖苷鍵結(jié)合成的直鏈，直鏈間彼此平行，不呈螺旋構(gòu)象，無分支結(jié)構(gòu)，又稱為β-1,4-葡聚糖。BC的發(fā)現(xiàn)至今已有一百多年的歷史，但由于生產(chǎn)成本高，對其物理特性了解不夠充分，以致其應(yīng)用受到限制。最近十幾年隨著對BC生物合成機(jī)制的深入了解，以及發(fā)酵條件的改善，BC的工業(yè)應(yīng)用逐步加速。目前，BC主要應(yīng)用于附加值較

2、高的領(lǐng)域。在聲音振動膜、高強(qiáng)度紙、新型傷口包扎材料等產(chǎn)品的研制中已進(jìn)入實(shí)用化階段，在其他方面也具有廣泛的商業(yè)化應(yīng)用潛力。關(guān)于BC的研究已成為當(dāng)今新的微生物合成材料研究的熱點(diǎn)之一 纖維素合成酶對BC合成具有重要的影響。BC的最終合成是依賴于纖維素合成酶完成的，纖維素合成酶活力的高低，表達(dá)量的多少，直接影響到BC的合成及產(chǎn)量高低。然而纖維素合成酶的活力又與環(huán)鳥苷酸相關(guān)，環(huán)鳥苷酸(cyclicdiguanylicacid，c-di-G

3、MP)是纖維素合成酶的變構(gòu)激活劑，在BC的生物合成中，如果纖維素合成酶的變構(gòu)位點(diǎn)上沒有結(jié)合環(huán)鳥苷酸，纖維素合成酶將不具有活性。環(huán)鳥苷酸的合成與降解又與二鳥苷酸環(huán)化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)有關(guān)。二鳥苷酸環(huán)化酶催化環(huán)鳥苷酸的合成，磷酸二酯酶催化環(huán)鳥苷酸的降解。 本課題的研究思路就是通過提高纖維素合成酶變構(gòu)激活劑的量，達(dá)到提高細(xì)菌纖維素合成酶活力，使更多的脲苷二磷酸葡萄糖(UTPG)轉(zhuǎn)化為纖維素的目的。因此，利用插入失活的原理

4、，敲除編碼PDE的基因pde基因，阻斷PDE的合成，提高細(xì)菌纖維素合成酶活力，在理論上是可行的、合理的。雖有學(xué)者推測在培養(yǎng)基中添加PDE抑制劑，提高纖維素合成酶活力，但未見有研究性資料。因此，利用基因工程技術(shù)阻斷PDE對環(huán)鳥苷酸的抑制，提高細(xì)菌纖維素合成酶活力是本課題的創(chuàng)新點(diǎn)。 本研究以篩選的BC生產(chǎn)菌為試驗(yàn)菌，通過敲除對纖維素合成酶變構(gòu)激活劑有抑制作用的pde基因，解除磷酸二酯酶(PDE)對細(xì)菌纖維素合成酶激活劑的降解作用，構(gòu)

5、建高產(chǎn)菌株。研究內(nèi)容包括：1)提取并擴(kuò)增pde基因，通過試驗(yàn)確定能大量擴(kuò)增pde基因的最佳條件；2)利用基因敲除法獲得pde基因；3)選擇合適的載體，將失活基因重組到試驗(yàn)菌株中，確定適宜的重組條件；4)篩選、鑒定重組子并對所得重組菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究；5)對重組菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證研究。 本研究確定了一種纖維素生產(chǎn)菌株菌體細(xì)胞收集方法，收集條件為：種子液接種量2mL，涂布于φ12cm的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，刮膜至10mL無菌水中

6、，漩渦混合儀振蕩1min，無菌脫脂棉過濾，濾液在12000r/min下離心10min即可。 本研究分別考察了pde基因片斷、ampr基因PCR擴(kuò)增時影響最大的兩個因素：Mg2+濃度和復(fù)性溫度。確定pde基因片斷PCR擴(kuò)增時Mg2+濃度為3mM，復(fù)性溫度為50℃；ampr基因PCR擴(kuò)增時Mg2+濃度為為2mM，復(fù)性溫度為36℃。 本研究利用基因敲除的原理，成功構(gòu)建了pde-基因，同時將pde-基因重組到試驗(yàn)菌株中，構(gòu)建了p

7、de-基因型重組菌株。 本研究對pde-基因型重組菌株進(jìn)行了發(fā)酵研究，比較了重組菌株與出試驗(yàn)菌株BC產(chǎn)量，得出：所篩選10株pde-基因型重組菌株BC產(chǎn)量均稍有提高，最大產(chǎn)率提高了4.8％，但提高幅度不是很大，原因可能是細(xì)胞體內(nèi)PDE不能表達(dá)后，引起代謝途徑發(fā)生改變。原來的發(fā)酵條件可能已經(jīng)不適合重組菌株的發(fā)酵生產(chǎn)。因此pde-基因型重組菌株BC產(chǎn)量的提高還有待于進(jìn)一步研究。 本研究最后對重組菌株遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果