應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)終止禽內(nèi)源性白血病病毒ALVE1表達(dá)及其功能初探.pdf

1、據(jù)稱，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retroviruses，ERVs)是遠(yuǎn)古反轉(zhuǎn)錄病毒感染時(shí)留下的痕跡，構(gòu)成了機(jī)體“virome”的重要組成部分。過(guò)去對(duì)內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能不夠了解，曾將其視為“垃圾DNA”(Junk DNA)。但最近有研究表明，某些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒不僅對(duì)早期胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞的多能性具有重要作用，還可能與病毒感染、天然免疫以及抗腫瘤作用有關(guān)。本研究選擇內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒一雞內(nèi)源性白血病病毒(Avianle

2、ukosis virus subgroup E，ALVE)作為研究模型，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)雞1號(hào)染色體上存在的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1進(jìn)行去表達(dá)以探索其與天然免疫之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能和作用奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)將轉(zhuǎn)錄終止序列(SV40 ployA)敲入內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1的啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)終止其轉(zhuǎn)錄從而實(shí)現(xiàn)ALVE1的去功能(Loss of functio

3、n)。本文不僅成功構(gòu)建了針對(duì)家禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒去功能研究的新方法，還為今后研究?jī)?nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能提供了新思路。主要的研究結(jié)果如下:
　　1、ALVE1的鑒定及轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析:首先，應(yīng)用反式PCR(Inverse PCR)與cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，成功鑒定了ALVE1在雞1號(hào)染色體的具體位置信息，獲得了完整的ALVE1序列。然后，將ALVE1序列分成

4、三部分，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示:在雞巨噬細(xì)胞系HD11中含有完整的ALVE1序列，而在雞成纖維細(xì)胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后，通過(guò)PCR鑒定ALVE1在HD11中的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明: ALVE1的四個(gè)區(qū)域（即LTR、gag、pol和env）在雞巨噬細(xì)胞系HD11中均能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　2、轉(zhuǎn)錄終止元件的篩選:為了篩選高效的轉(zhuǎn)錄終止序列，本研究構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)錄終止序列以及綠色熒光蛋白GFP的載體，通過(guò)對(duì)GFP熒

5、光的觀察以及熒光定量PCR檢測(cè)，分別比較SV40 polyA、4×SV40 polyA、β-globin和β-globin△5-7四個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列的終止效率。結(jié)果顯示:四個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列都有較高的終止活性，其終止效率均高于90％。在四個(gè)終止序列中，由于SV40 polyA的序列最短，本文最終選定SV40 polyA作為本研究的終止元件。在此基礎(chǔ)上，本文還繼續(xù)探索了正向與反向SV40 polyA的終止效率，結(jié)果表明:正向與反向的SV40 p

6、olyA均有轉(zhuǎn)錄終止活性，但是反向序列的終止活性遠(yuǎn)低于正向序列。
　　3、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ALVE1轉(zhuǎn)錄終止及其功能初探:為了實(shí)現(xiàn)ALVE1去功能以研究其與天然免疫之間的關(guān)系，本文構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)錄終止序列的同源重組載體，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將其敲入ALVE1的啟動(dòng)子區(qū)，然后通過(guò)嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)雙篩選，最終獲得了ALVE1被終止轉(zhuǎn)錄的雞巨噬細(xì)胞系(命名為:HD11-ALV