產(chǎn)碳青霉烯酶革蘭陰性桿菌的耐藥及傳播機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著各種抗生素的大量使用，多重耐藥甚至泛耐藥細(xì)菌不斷增多，給臨床診治帶來巨大的挑戰(zhàn)，現(xiàn)已成為一個(gè)世界性難題。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌嚴(yán)重感染的最后一道防線，耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌的快速傳播越來越引起關(guān)注。產(chǎn)碳青霉烯酶是這類細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，碳青霉烯酶包括 Ambler分子分類中的A、B、D三類酶，是指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶。大多數(shù)碳

2、青霉烯酶基因位于可轉(zhuǎn)移性基因元件上如質(zhì)粒、整合子等，在同種屬和不同種屬的細(xì)菌可以通過接合、傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座等方式獲得耐藥基因，導(dǎo)致更多細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶。耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，同時(shí)多數(shù)也對(duì)喹諾酮、氨基糖苷等其他類抗生素耐藥，從而表現(xiàn)出多耐藥甚至泛耐藥的特性。因此，使用快速方法檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶，對(duì)控制這類細(xì)菌的傳播和感染具有重要意義。
　　目前產(chǎn)碳青霉烯酶的檢測(cè)方法主要有改良的Hodge實(shí)驗(yàn)(t

3、he modified Hodge test)這是一個(gè)表型實(shí)驗(yàn)，這是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的表型確證試驗(yàn)。另外還有亞胺培南-EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)及Etest MBL商品化確認(rèn)試條，專門針對(duì)B組碳青霉烯酶的檢驗(yàn)[1]。但是，隨著耐藥菌株所含耐藥基因的組合和種類越趨復(fù)雜，上述方法的特異性和敏感性受到挑戰(zhàn)，產(chǎn)碳青霉烯酶的檢測(cè)方法亟待革新。美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Stand

4、ards Institute，CLSI）于2015年引入了Carba NP試驗(yàn)[2]，作為腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動(dòng)菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶表型檢測(cè)的確證試驗(yàn)，由法國(guó)南法醫(yī)學(xué)院Patrice Nordmann教授研究團(tuán)隊(duì)于2012年首次報(bào)道[3]，此后，陸續(xù)優(yōu)化該方法用于檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶假單胞菌及指示碳青霉烯酶類型的Carba NP試驗(yàn)Ⅱ已有報(bào)道[4]，該試驗(yàn)?zāi)苤苯优卸óa(chǎn)碳青霉烯酶菌株的產(chǎn)酶類型，較改良的Hodge試驗(yàn)更簡(jiǎn)單、快速。<

5、br>　　隨著分子生物學(xué)和生物信息分析學(xué)的快速發(fā)展，使得全基因組測(cè)序技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。全基因組測(cè)序是對(duì)物種未知基因組全序列進(jìn)行測(cè)序。目前，全基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用比較多的主要是第二代測(cè)序技術(shù)（NGS）和第三代測(cè)序技術(shù)。第二代測(cè)序技術(shù)能夠快速、低成本的進(jìn)行全基因組測(cè)序，其設(shè)備供應(yīng)商主要是454（羅氏公司），SOLiD（AB公司）和Solexa。第三代測(cè)序技術(shù)于2011年開始推廣，其單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）與第二代測(cè)序完全不同，由Pac

6、ific Biosciences公司研發(fā)，它的序列讀長(zhǎng)高達(dá)3kb。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得人類獲得基因組方式出現(xiàn)重大變革，特別是在基因組信息較小的微生物領(lǐng)域，已成為病原微生物的鑒定分型、致病機(jī)理研究等一項(xiàng)不可取代的工具。
　　本研究采用CLSI推薦的Carba NP試驗(yàn)，對(duì)本院可疑產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥革蘭陰性桿菌進(jìn)行篩選，以多重 PCR方法對(duì)篩選陽性的結(jié)果進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，以了解我院革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶流行情況，并探討Car

7、ba NP試驗(yàn)檢測(cè)方法的優(yōu)劣。對(duì)來源同一病人的4株產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行接合/轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，比較接合/轉(zhuǎn)化菌和親本菌株的藥物敏感性差異，并分析4株菌的同源性。通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中1株攜帶blaKPC-2的多重耐藥菌株作全基因組測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析，了解肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制和耐藥基因環(huán)境等特點(diǎn)。
　　研究目的：
　　1.了解廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥革蘭陰性桿菌的流行及耐藥分子機(jī)制。

8、>　　2.了解Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶的效果。
　　3.來源同一病人4株肺炎克雷伯菌株耐藥性及同源性分析。
　　4.用高通量測(cè)序方法分析1株KPC陽性肺炎克雷伯菌株的基因環(huán)境。
　　研究方法：
　　1.收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室2010年1月－2013年10月臨床分離的59株多重耐藥的革蘭陰性桿菌，所有菌株用VITEK2微生物全自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)三種以上抗菌藥物

9、耐藥的革蘭陰性桿菌菌株，且對(duì)至少一種碳青霉烯類抗生素耐藥，即為可疑產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，并對(duì)標(biāo)本類型、碳青霉烯類藥物敏感性等資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其流行病學(xué)特點(diǎn)。
　　2.采用Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株，并用多重PCR技術(shù)對(duì)碳青霉烯酶表型試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)，了解本院革蘭陰性桿菌碳青霉烯酶的主要基因型，并探討Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)革蘭陰性桿菌碳青霉烯酶的效果。
　　3.通過接合試驗(yàn)和電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)獲得4株肺

10、炎克雷伯菌接合子或轉(zhuǎn)化子，受體菌攜帶耐藥基因blaNDM-1或blaKPC-2，提取質(zhì)粒DNA，通過酶切技術(shù)分析質(zhì)粒類型。
　　4.分別提取多重耐藥菌株LJ1、LJ2、LJ3、LJ4的總DNA，ERIC-PCR方法分析同源性和質(zhì)粒不相容群，通過PCR方法檢測(cè)7個(gè)肺炎克雷伯菌管家基因，利用MLST網(wǎng)上工具進(jìn)行ST分型，進(jìn)一步分析這些菌株的同源性。
　　5.提取轉(zhuǎn)化子LJ4C總DNA，用Illumina Miseq和PacBio

11、 RS II平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。由Celera Assembler軟件進(jìn)行組裝。在其PBcR pipeline中，用Illumina MiSeq Reads（二代測(cè)序）的數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)。RAST網(wǎng)上工具進(jìn)行基因注釋， ResFinder和NCBI BLAST網(wǎng)上工具進(jìn)行耐藥基因分析，NCBI BLAST網(wǎng)上工具進(jìn)行耐藥基因遺傳環(huán)境分析，PlasmidFinder網(wǎng)上工具進(jìn)行質(zhì)粒序列分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.59株多重耐藥

12、的革蘭陰性桿菌的流行病學(xué)和藥敏結(jié)果分析。
　　59株多重耐藥革蘭陰性桿菌對(duì)亞胺培南、美洛培南、厄他培南耐藥率分別為62.71％，61.02%，64.41%。菌株主要來源于痰液35.6%（21/59）膽汁5.1%（3/59）、分泌物8.5%（5/59）、腹水5.1%（（3/59）、尿液13.6%（8/59）、胸水3.4%（2/59）、血液23.7%（14/59）、引流液5.1%（3/59）。多重耐藥革蘭陰性桿菌中以攜帶NDM-1基因

13、和攜帶 KPC-2基因型菌株為主，而產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌以弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌等比較常見。
　　2. Carba NP試驗(yàn)和多重PCR檢測(cè)結(jié)果分析比較。
　　Carba NP試驗(yàn)確定33株產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，分別為A類酶12株、B類酶21株，PCR法檢出多種碳青霉烯酶，包括KPC（12株）、IMP(7株)、NDM(12株)、VIM(3株)。與PCR法比較，Carba NP試驗(yàn)敏感性和特異性分別為97.06

14、%和100%。
　　3.3株肺炎克雷伯菌LJ1-LJ3攜帶耐藥基因blaNDM-1，這些菌株可通過接合方式傳遞耐藥基因，攜帶耐藥基因 blaKPC-2菌株LJ4接合不成功，需用電轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子。S1核酸內(nèi)切酶分析4株菌有三種質(zhì)粒類型。
　　4.用 ERIC-PCR方法分析LJ1、LJ2、LJ3、LJ4菌株同源性，LJ1和LJ2高度同源，與LJ3、LJ4菌有不同的帶型。LJ3、LJ4不屬于18個(gè)已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒不相容群的任何一種，L

15、J1、LJ2屬于不相容群IncF II群。通過7個(gè)肺炎克雷伯菌管家基因檢測(cè)，MLST網(wǎng)上工具進(jìn)行分析，在 LJ1和 LJ2為新發(fā)現(xiàn) ST型，均為ST1416，LJ3為ST20，LJ4為ST11。
　　5. PCR法證實(shí)多重耐藥產(chǎn)碳青霉烯酶菌株LJ4攜帶blaKPC-2型碳青霉烯酶基因，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得來自LJ4菌株的質(zhì)粒pCT-KPC，是一個(gè)151466 bp的環(huán)狀分子，包括120783bp的質(zhì)粒骨架，有編碼，復(fù)制起始，轉(zhuǎn)

16、移，維持和穩(wěn)定功能的編碼區(qū)以及包含兩段耐藥基因的編碼區(qū)（MRR）。pCT-KPC質(zhì)粒含有53.81％的GC含量，總共有233個(gè)已鑒定的開放閱讀框ORFs，138個(gè)編碼基因與已知有功能的蛋白質(zhì)有高度相似性。質(zhì)粒LJ4C是由pHN7A8、pKPC-LK30的部分質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及一個(gè)額外的tra區(qū)域構(gòu)成一個(gè)嵌合體，接合轉(zhuǎn)移基因簇tra與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　6.對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)， LJ4菌株的轉(zhuǎn)化子同時(shí)攜帶 blaCTX-M-65、bla

17、fosA3、blarmtB、blaSHV、blaTEM1b及 blaKPC-2多個(gè)耐藥基因。blafosA基因在家禽和寵物之間廣泛傳播，本研究結(jié)果顯示在病人身上分離的病原菌株質(zhì)粒跟寵物來源的菌株質(zhì)粒結(jié)構(gòu)高度同源，不排除在病患寵物及家禽與人類來源細(xì)菌發(fā)生同源重組的可能。
　　結(jié)論：
　　1.我院產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌以弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌等比較常見，提示臨床上如果檢出了此類多重耐藥菌株，應(yīng)注意篩查其產(chǎn)生碳青

18、霉烯酶的狀況，以便合理應(yīng)用抗菌藥物。
　　2. Carba NP試驗(yàn)用于多重耐藥革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶的篩查簡(jiǎn)單、易行、快速、準(zhǔn)確，可在臨床實(shí)驗(yàn)室中推廣使用。
　　3.已出現(xiàn)同時(shí)攜帶ESBLs、fosA、rmtB、KPC基因質(zhì)粒的菌株，質(zhì)粒攜帶的blaNDM-1和blaKPC-2基因可通過接合或轉(zhuǎn)化的方式在同種細(xì)菌間傳播，預(yù)示這些多重耐藥基因在細(xì)菌間有水平播散的可能。
　　4.高通量測(cè)序可快速、全面、準(zhǔn)確地對(duì)耐藥基因