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文檔簡介
1、;.- - I :I L 醫(yī)科大學學位論文使用授權及知識產(chǎn)權歸屬承諾本學位論文在導師( 或指導小組) 的指導下,由本人獨立完成。本學位論文研究所獲得的研究成果,其知識產(chǎn)權歸河北醫(yī)科大學所有。河北醫(yī)科大學有權對本學位論文進行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學位論文主要內(nèi)容相關的論文,第一署名為單位河北醫(yī)科大學,試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權均歸河北醫(yī)科大學所有。否則,承擔相應法律責任。研究生簽名:弓粕色導師簽章: 二級學院領導蓋章≥嘶
2、≯0 乃,r 年,7 月 / .1 ,, ‘ /U ,.J ● 1 ,J 砍V 陶曠‘。河北醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本論文是在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特別加以標注和致謝等內(nèi)容外,文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果,指導教師對此進行了審定。本論文由本人獨立撰寫,文責自負。研究生簽名:穢池 導師簽章:墨弋%分 導師簽章: 麥弋孤擴洲廠年/1 月均日中文摘要A 族鏈球菌p c D N A 3 .1 /S
3、 p y 0 7 4 7 基因疫苗的制備及免疫效果分析摘 要目的:A 族鏈球菌( G r o u p A s t r e p t o c o c c u s ,G A S ) ,是- I 中人類特異性致病菌,又稱化膿性鏈球菌,它通過飛沐、皮膚接觸傳播,在全球分布廣泛。G A S 既能引起咽喉炎、膿皰病等較輕的感染,也能引起風濕性心臟病、關節(jié)炎、腎小球腎炎等后遺癥,還會導致敗血癥、鏈球菌中毒休克綜合癥等嚴重疾病。皮膚和上呼吸道是G A S
4、 最常寄居的部位,> 2 0 %兒童是無癥狀帶菌者,全球每年大約有5 0 萬人死于鏈球菌感染性疾病。雖然鏈球菌仍然對抗生素敏感,但耐藥的報道也在不斷增加。因此,近‘百年來人們一直在尋找能有效預防鏈球菌的疫莆,但很遺憾,目前仍然沒有一個安全有效的疫苗用于臨床。近年來,人們應用互補基因組技術在G A S表面篩選了一些細菌表面抗原,有些已經(jīng)通過動物實驗驗證有一定的免疫保護作用。S p y 0 7 4 7 是鏈球菌表面的一種D N A 酶
5、,因為它和豬鏈球菌表面D N A 酶S s n A 具有同源性,并且其活性的發(fā)揮都需要C a 2 + 和M g ’2 + ,所以S p y 0 7 4 7 又被稱為S p n A 。S p n A 在目前已知的鏈球菌種群中有很廣泛的分布,它能誘導產(chǎn)生相應的抗體,在核酸實驗中,這些抗體能夠抑制S p n A 的活性,并且S p n A 的基因突變?nèi)笔途甑亩玖γ黠@F 降,這說明S p n A 具有丌發(fā)疫苗的潛力。本研究擴增了S p n
6、A 蛋白的編碼基因,并連接到真核表達質(zhì)粒上制成核酸疫苗,通過動物實驗來驗證該疫苗的有效性i 。方法: ( 1 ) 引物設計:本實驗的日的基兇為S p y 0 7 4 7 基區(qū)I ,其引物用p r i m e r p r e m i e r5 .0 軟件進行設計,經(jīng)P C R 方法擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化。 ( 2 ) P G E M —T /S p y 0 7 4 7 構建:P C R 擴增產(chǎn)物與P G E M —T v e
7、c t o r 連接,轉(zhuǎn)化基兇工程菌E .c o l iD H 5 Q ,并構建克隆載體,在設計的酶切位點處用B a m HI 、X h oI 雙酶切并電泳鑒定,之后測序鑒定。 ( 3 ) p c D N A 3 .1 /S p y 0 7 4 7 構建:回收克隆載體上S p y 0 7 4 7 的片段,連接于p c D N A 3 .1 載體,它們預先經(jīng)同樣的酶切回收。構建的暈組質(zhì)粒為真核表達質(zhì)粒,經(jīng)鑒定后一2 0 。C 保存待用。(
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