金蓮花總黃酮抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖作用機制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的腫瘤，嚴重威脅女性的身心健康。每年全球約有超過100萬的女性診斷為乳腺癌，同時有40萬女性因此而死亡。歐美國家的乳腺癌發(fā)病率較高，我國的乳腺癌發(fā)病率近年來也呈上升趨勢。目前乳腺癌治療以手術為主，配合放、化療等綜合治療，但放、化療也帶來了嚴重的毒副反應。因此臨床上急需尋找和開發(fā)毒副作用小、療效好的抗乳腺癌腫瘤新藥物。
　　金蓮花是毛茛科植物金蓮花trollius chinensis的干燥花及花蕾，有清熱解毒的功效

2、，民間常用來治療扁桃體炎，口腔喉腫，急性腸炎等。
　　現(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花總黃酮為其主要有效成份，具有很好的體內外抗氧化，抗病毒，抗炎，抗菌，降壓和解痙等作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮對乳腺癌細胞具有增殖抑制作用，但作用機制未完全闡明。本實驗利用HE染色，熒光顯微鏡，微分干涉，掃描電鏡，聚光共聚焦顯微鏡對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的形態(tài)進行多途徑觀察。用western blot技術測定細胞凋亡相關的蛋白表達，闡述了細胞

3、凋亡的可能作用機制，為開發(fā)抗乳腺癌新藥物提供動力。
　　實驗方法：
　　實驗分為正常組，溶劑對照組，藥物組(0，0.0991，0.1982，0.3964，0.7928，1.5856mg·mL1)，時間設定為24，48，72 h。采用MTT法檢測細胞的增殖抑制率，微分干涉顯微鏡(DIC)的應用從立體的角度進一步直觀的證實細胞的凋亡，HE染色觀察細胞核和胞質的變化，Hoechst33258熒光法觀察細胞凋亡過程中細胞核的變化，掃

4、描電鏡觀察細胞表面的變化，激光共聚焦通過標記細胞膜表面磷脂酞絲氨酸蛋白和細胞核來反映細胞凋亡過程的變化。Western blot方法測定凋亡相關蛋白bcl-2，NF-κB，p53，caspase-3，9，F(xiàn)asL的表達。
　　實驗結果：
　　1.金蓮花總黃酮對乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制作用
　　不同濃度的金蓮花總黃酮對乳腺癌MCF-7細胞均具有增殖抑制作用。與正常組相比，溶劑組DMSO的最大抑制率不超過1％，其對細胞

5、增殖及活性幾乎無影響，故后面的實驗不再設溶劑組。同一時相，不同濃度藥物對MCF-7細胞增殖抑制率隨藥物濃度的增高而增高，與正常組相比具有顯著性差異(P＜0.05);且不同濃度組之間，對MCF-7細胞增殖抑制率相比具有顯著性(P＜0.05)。不同時相，相同濃度藥物組對MCF-7細胞增殖抑制率隨時間延長而增高，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.金蓮花總黃酮促乳腺癌MCF-7細胞凋亡形態(tài)學觀察
　　2.1 微分干涉觀察細胞

6、形態(tài)
　　正常組MCF-7細胞排列緊密，細胞大小均勻。經(jīng)藥物處理后，細胞回縮，形態(tài)逐漸變圓，細胞間連接變松散、稀疏。貼壁細胞數(shù)量減少，細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起“膜氣泡”。細胞核膨大，胞質固縮，表現(xiàn)出典型的凋亡細胞形態(tài)學特征，且隨藥物濃度的增加，凋亡細胞數(shù)增多，細胞凋亡形態(tài)學改變越來越明顯。
　　2.2 HE染色結果
　　正常組MCF-7細胞呈梭形貼壁生長，細胞完整，核質染色均勻，核仁明顯，核質比例大，細胞間結構

7、緊密，可見處于分裂期的細胞。與正常組相比，0.0991，0.1982，0.3964 mg· mL-1不同濃度藥物作用后，MCF-7細胞處于分裂期的細胞消失，細胞皺縮變形，體積變小，細胞間隙逐漸增大，連接稀疏。染色質濃縮，被染成藍黑色。而藥物濃度為0.7964，1.5856 mg· mL-1時，MCF-7細胞的細胞膜連續(xù)性完全被破壞，且貼壁的MCF-7細胞數(shù)目減少很多，與DIC軟件拍攝細胞形態(tài)以及掃描電鏡所表達的隨濃度增大細胞凋亡數(shù)目增多

8、相一致。
　　2.3 Hoechst染色觀察細胞形態(tài)
　　正常組MCF-7細胞，核形態(tài)規(guī)則，大小均一，發(fā)出淡藍色均勻彌散的熒光。經(jīng)藥物處理后細胞發(fā)生凋亡，貼壁細胞數(shù)目減少，核皺縮，呈現(xiàn)致密熒光，濃染比例增加，且細胞核發(fā)生碎裂，表現(xiàn)為塊狀或點狀藍色熒光。隨藥物濃度的增加，典型的凋亡形態(tài)學改變越來越明顯。
　　2.4 掃描電鏡結果
　　正常組MCF-7細胞表面的微絨毛豐富且粗壯，細胞完整，呈葵花狀。胞質向四周伸展，與

9、臨近細胞相連，并緊貼于支持物生長。與正常組相比，不同藥物組細胞表面微絨毛萎縮，散在細胞周圍。細胞收縮，體積變小，細胞間連接斷裂。隨藥物濃度的增加，凋亡細胞數(shù)逐漸增多，細胞典型的凋亡形態(tài)學改變逐漸明顯，且呈現(xiàn)出不同階段的凋亡特征。在藥物濃度為0.7964，1.5856 mg· mL-1時，細胞膜表面凹陷，甚至產(chǎn)生類似空洞的結構。
　　2.5 激光共聚焦（AnnexinⅤ-FITC雙標法）觀察結果
　　正常組MCF-7細胞不被A

10、nnexinⅤ或PI染色。與正常組相比，不同濃度藥物組均可誘導MCF-7細胞凋亡，其中，藥物組早期凋亡MCF-7細胞的PS蛋白外翻到細胞膜表面，AnnexinⅤ高染呈綠色熒光。藥物組中晚期凋亡MCF-7細胞的細胞膜被破壞，PI進入細胞標記細胞核，開始出現(xiàn)紅色熒光，AnnexinⅤ和PI均高染，呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)?？傊?，藥物作用后細胞凋亡形態(tài)學發(fā)生改變，呈現(xiàn)出典型的細胞凋亡特征。
　　3.金蓮花總黃酮誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡

11、作用
　　Western結果表明，與正常組相比，隨藥物濃度增加，MCF-7細胞內FasL和p53蛋白的表達水平無明顯變化，說明金蓮花總黃酮對FasL和p53蛋白的表達無影響;而金蓮花總黃酮能夠下調MCF-7細胞中NF-κB和Bcl-2蛋白的表達，能夠提高MCF-7細胞中caspase-3和caspase-9的蛋白水平。
　　實驗結論：
　　1.金蓮花總黃酮能夠抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡。
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