產(chǎn)脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318的分離鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其脂肪酶基因的克隆表達(dá).pdf

1、脂肪酶在食品、藥品、洗滌劑、化妝品和生物柴油合成等領(lǐng)域擁有廣泛的用途，并且備受人們關(guān)注。發(fā)掘具有脂肪酶高產(chǎn)潛力的微生物資源及其基因資源并加以開(kāi)發(fā)利用對(duì)脂肪酶的酶學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。
　　本文主要進(jìn)行了以下方面的研究:
　　(1)產(chǎn)脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318篩選和鑒定:采用吐溫平板與橄欖油油脂板結(jié)合的方法從采集自河北省各地油污豐富的122份土樣中初步篩選到57株脂肪酶產(chǎn)生菌。

2、用p-NPP法復(fù)篩獲得一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株Lipa1318，酶活達(dá)到2.56U/mL。通過(guò)對(duì)該菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征及主要生理生化特征的鑒定確認(rèn)其是粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens);PCR擴(kuò)增得到該菌株1535 bp長(zhǎng)的16S rDNA保守序列，與NCBI公布的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)最終確定該菌株為S.marcescens，故將該菌株命名為S.marcescens Li

3、pa1318。對(duì)菌株Lipa1318粗酶液的最適溫度、最適pH值及溫度和pH值穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明該菌株脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH為8.0，此條件下酶活為3.56 U/mL。該酶在50℃下保溫1h后酶活保持約90％;在pH值5.0～11.0之間，30℃保溫2.5 h后，酶活仍保持70％，說(shuō)明該酶是一種耐熱堿性脂肪酶，且具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。
　　(2)S.marcescens Lipa1318產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件

4、優(yōu)化:通過(guò)單因子試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design-Expert V8.0.6.1對(duì)菌株S.marcescens Lipa1318進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示該菌株的最適產(chǎn)酶條件為:在含1.0％的牛肉膏、0.31％的葡萄糖、0.15％酵母粉、0.54％ TritonⅩ-100、0.50 mmol/L Ca2+、初始pH8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按4％接種量接種于裝液量為60 mL的300 mL三角瓶中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)96 h，最高酶活可達(dá)（1

5、3.95±0.07）U/mL。按照上述培養(yǎng)條件對(duì)菌株Lipa1318進(jìn)行10L發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵液酶活力提高到25.32 U/mL，較搖瓶發(fā)酵的酶活提高了近2倍。
　　(3)S.marcescens Lipa1318脂肪酶基因的克隆和表達(dá):根據(jù)GenBank中已知的S.marcescens脂肪酶基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，成功克隆了S.marcescens Lipa1318的脂肪酶基因并命名為lipA，GenBank登錄號(hào)為KJ669102

6、。lipA長(zhǎng)1845 bp，同源序列比對(duì)結(jié)果表明lipA基因與其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶基因同源性高達(dá)94-99％; lipA基因編碼614個(gè)氨基酸，分子量為65 kDa，與其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶至少有2個(gè)氨基酸的差異。通過(guò)軟件成功對(duì)該脂肪酶蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的中后段即第484-539個(gè)氨基酸殘基處為該蛋白的保守區(qū)。將lipA基因分別插入表達(dá)載體pET-21b及pET-