T細(xì)胞受體δ2鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）3與抗原結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)—一個(gè)利用細(xì)胞膜表達(dá)不同CDR3δ移植型TCRγδ技術(shù)的研究例證.pdf

1、晚近，固有免疫中的細(xì)胞成分-γδT細(xì)胞在抗感染免疫、腫瘤免疫、免疫調(diào)節(jié)以及自身免疫等方面的重要作用廣受關(guān)注。然而，與承擔(dān)特異性細(xì)胞免疫功能、MHC-抗原肽-TCRαβ三元體結(jié)構(gòu)解析較為清楚的αβT細(xì)胞形成鮮明對(duì)比的是，免疫學(xué)術(shù)界對(duì)γδT細(xì)胞受體(TCRγδ)識(shí)別抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)所知甚少，同時(shí)TCRγδ所識(shí)別的抗原鑒定工作也進(jìn)展緩慢。 研究表明，TCRγδ鏈，尤其是TCRδ鏈上的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)是與抗原表位結(jié)合的關(guān)鍵部位。近年

2、來(lái)，我們實(shí)驗(yàn)室選擇TCRδ2鏈的CDR3(CDR3δ)為研究對(duì)象，在CDR3合成多肽、CDR3移植性Ig與腫瘤靶細(xì)胞、靶組織以及腫瘤細(xì)胞提取蛋白的相互作用機(jī)制方面做了大量的工作，驗(yàn)證了CDR3δ是’FCRδ2鏈與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為了更真實(shí)地反應(yīng)TCRγδ的結(jié)合活性，本研究中，我們通過(guò)TCRγδ重建技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)利用細(xì)胞膜表達(dá)不同CDR3δ移植型TCRγδ異質(zhì)二聚體的技術(shù)體系，來(lái)研究CDR3δ與抗原特異性結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一方面

3、，該技術(shù)體系也為尋找γδT細(xì)胞的抗原表位提供新的方法。 本文的主要工作及學(xué)術(shù)成果如下： 一、CDR3δ與抗原結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 1.構(gòu)建了CDR3區(qū)移植型TCRγδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 將嵌合了特異性CDR3區(qū)序列的全長(zhǎng)γ9和δ2鏈共轉(zhuǎn)染J.RT3-T3.5細(xì)胞，使其細(xì)胞膜表面表達(dá)TCRγδ，構(gòu)建了CDR3區(qū)移植型TCRγδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。這種TCRγδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞系能夠模擬γδT細(xì)胞特異性識(shí)別抗原。 2.TCRγ

4、δ識(shí)別抗原的關(guān)鍵部位是CDR38 我們構(gòu)建了卵巢癌TIL中δ2的特異性CDR3序列OT3移植型TCRγδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，命名為OT3γδTCR細(xì)胞。OT3γδTCR細(xì)胞在多種腫瘤細(xì)胞的刺激作用后，活化分泌IL-2。同時(shí)，這種活化作用能被抗TCRγδ的單克隆抗體所阻斷。OT3γδTCR細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞也具有細(xì)胞毒作用，殺傷活性也能被抗TCRγδ的單克隆抗體所阻斷。另外，γ9鏈和OT3δ2鏈共轉(zhuǎn)染及單獨(dú)的OT3δ2鏈轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在腫瘤抗

5、原刺激后IL-2的表達(dá)沒(méi)有差異，提示TCRγδ與腫瘤抗原的結(jié)合主要依賴TCRδ2鏈。OT3γδTCR細(xì)胞與腫瘤抗原的反應(yīng)性高于無(wú)關(guān)CDR3序列對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞(即兩種細(xì)胞表達(dá)的TCR具有相同的γ9鏈和攜帶不同CDR3區(qū)序列的δ2鏈)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，OT3γδTCR細(xì)胞能夠模擬γδT細(xì)胞特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞抗原，并且TCRγδ識(shí)別抗原的過(guò)程中CDR3δ起著關(guān)鍵的作用。 3.CDR3δ的側(cè)翼序列是抗原結(jié)合特異性的關(guān)鍵決定簇

6、為了進(jìn)一步探討CDR3δ與配體作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們將OT3的V、D和J區(qū)突變體相對(duì)應(yīng)的核甘酸序列嵌入到完整的δ2鏈中，與相同的γ9鏈共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建各個(gè)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別命名為VmOT3γδTCR、DmOT3γδTCR和JmOT3γδTCR細(xì)胞。在γδTCR表達(dá)率相同的前提下，比較各個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，VmOT3γδTCR細(xì)胞和JmOT3γδTCR細(xì)胞在HO8910、Hela和SKOV3細(xì)胞總蛋白及HSP70、hM

7、SH2N端蛋白(MNS)和C端蛋白(MCS)刺激作用下，細(xì)胞活化表達(dá)IL-2的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于OT3γδTCR細(xì)胞的，而DmOT3γδTCR細(xì)胞表達(dá)IL-2的量降低不明顯。同時(shí)，在不同的效靶比時(shí)，VmOT3γδTCR細(xì)胞和JmOT3γδTCR細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于OT3γδTCR細(xì)胞的，而DmOT3γδTCR細(xì)胞的殺傷活性降低不明顯。這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室前期用OT3突變肽檢測(cè)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特性相吻合，進(jìn)一步提示，正是側(cè)翼序

8、列(V和J)決定了TCRδ2-CDR3與靶細(xì)胞的結(jié)合。 4.CDR3δ97位的疏水性氨基酸在識(shí)別非肽抗原和蛋白抗原方面的差異 我們用相同的方法也構(gòu)建了OT10γδTCR轉(zhuǎn)染細(xì)胞，OT10是在δ97位具有疏水性氨基酸的CDR3δ序列。非肽抗原刺激OT10γδTCR細(xì)胞能分泌IL-2，而當(dāng)用點(diǎn)突變的方法將δ97的異亮氨酸(I)突變成同樣疏水性氨基酸亮氨酸(L)以及酸性氨基酸天冬氨酸(D)和羥基類氨基酸絲氨酸(S)后，這些突變

9、體轉(zhuǎn)染細(xì)胞在非肽抗原刺激作用后IL-2的表達(dá)量有所差異。突變成亮氨酸后，IL-2的表達(dá)量下降不明顯，而突變成另外兩種氨基酸后，其IL-2的表達(dá)量降低明顯或幾乎沒(méi)有。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明δ97位置的疏水性氨基酸對(duì)于非肽抗原的識(shí)別至關(guān)重要。但是，δ97位的氨基酸突變卻不能改變轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞總蛋白的識(shí)別。提示CDR3δ97位的疏水性氨基酸在識(shí)別非肽抗原和蛋白抗原方面存在差異。 二、以O(shè)T3γδTCR細(xì)胞系為探針，利用差異篩選的

10、方法在噬菌體隨機(jī)展示肽庫(kù)中進(jìn)行抗原表位篩選 以O(shè)T3γδTCR細(xì)胞作為探針，用差異篩選的方法，在噬菌體十二肽庫(kù)中，篩選TCRγδ特異結(jié)合的十二肽，得到了兩條優(yōu)勢(shì)序列。人工合成的優(yōu)勢(shì)十二肽的結(jié)合特性分析與體外功能實(shí)驗(yàn)，證明這兩條十二肽都可為OT3γδTCR所識(shí)別，提示可能是其抗原表位。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明我們的策略是可行的。 本研究通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段進(jìn)一步驗(yàn)證了CDR3δ在抗原結(jié)合中所起的關(guān)鍵作用，即CDR3δ決定抗原結(jié)合的特

11、異性。我們所取得重要?jiǎng)?chuàng)新性科學(xué)發(fā)現(xiàn)為，首次發(fā)現(xiàn)CDR3δ側(cè)翼序列的V和J片段決定CDR3δ與配體的結(jié)合特異性。由于CDR3δ側(cè)翼序列在結(jié)構(gòu)上是呈現(xiàn)的保守特點(diǎn)，故在理論上推測(cè)其CDR3δ側(cè)翼序列只能與結(jié)構(gòu)同樣保守的蛋白多肽序列結(jié)合。在此意義上說(shuō)，TCRγδ所識(shí)別的配體是結(jié)構(gòu)保守和數(shù)量有限的。因此，這一發(fā)現(xiàn)為TCRγδ識(shí)別抗原的有限多樣性提供了強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)。 我們還首次創(chuàng)立了OT3γδTCR細(xì)胞作為探針，以差異篩選的方法，

12、在噬菌體十二肽庫(kù)中篩選TCRγδ特異結(jié)合的十二肽的新策略，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一策略是可行的。利用這一策略將為γδT細(xì)胞所識(shí)別的腫瘤抗原表位或腫瘤相關(guān)抗原表位的發(fā)現(xiàn)提供新思路和技術(shù)支持，進(jìn)而為腫瘤的診斷、免疫治療提供更多更的生物標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)，為圍繞γδT細(xì)胞所進(jìn)行的腫瘤治療的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 此外，實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)了新的人NKG2D的功能性配體，即ULBP4的三個(gè)剪切變體(ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-