PRRSV遺傳變異分析及其nsp2蛋白的定量相互作用組學(xué)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)主要以妊娠母豬發(fā)生明顯的繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病和生長(zhǎng)遲緩為主要特征，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。尤其是2006年由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引發(fā)的豬“高熱病”給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊。之后，2009年、2011年和2015年P(guān)RRS在我國(guó)都出現(xiàn)不同程度的暴發(fā)。此外，2015年來(lái)自美國(guó)的NADC30-like毒株在我國(guó)不同省

2、份引發(fā)母豬嚴(yán)重的流產(chǎn)或早產(chǎn)。因此，非常有必要對(duì)我國(guó)PRRSV流行病學(xué)、基因變異和同源重組等情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查，并掌握PRRSV的遺傳變異規(guī)律，為PRRSV的防控提供理論基礎(chǔ)。
　　PRRSV nsp2蛋白作為PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，也是PRRSV基因組中突變率最高的蛋白之一，可以通過(guò)對(duì)nsp2基因的監(jiān)控，以達(dá)到了解PRRSV的遺傳演化和變異規(guī)律的目的，更重要的是，nsp2能夠在病毒復(fù)制和免疫調(diào)控方面都發(fā)揮著非常重要的作用，因此，

3、本研究利用定量相互作用組學(xué)的方法對(duì)與nsp2相互作用的其他病毒蛋白和宿主蛋白進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.PRRSV流行病學(xué)調(diào)查及新毒株的分離鑒定
　　2010年至2015年間在我國(guó)東南17省收集了1909份臨床樣品，對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，其中PRRSV經(jīng)典株的陽(yáng)性率僅為3.87％，而HP-PRRSV毒株的陽(yáng)性率高達(dá)43.48％，且呈逐年下降趨勢(shì)。發(fā)現(xiàn)我國(guó)PRRSV的流行趨勢(shì)逐漸從以HP-PRRSV毒

4、株的流行為主，變?yōu)橐訬ADC30-like毒株的流行為主，并且有兩種毒株共感染的情況存在。同時(shí)發(fā)現(xiàn)豬的糞便樣品中也能檢測(cè)到PRRSV，陽(yáng)性率可達(dá)43.97％，并從中分離到一株HP-PRRSV: WUH4株，推測(cè)PRRSV可以通過(guò)糞-口途徑傳播這一新方式。此外，2014年以后在臨床上檢測(cè)到了PRRSV NADC30-like毒株的流行，陽(yáng)性率高達(dá)63.04％。在PRRSV NADC30-like陽(yáng)性樣品中，成功地分離到PRRSVWUH5和

5、WUH6兩株毒株。全基因組及各個(gè)蛋白序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)WUH5和WUH6株在nsp2的HV區(qū)域都存在130個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。通過(guò)同源重組進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)WUH6株為重組毒株，并推測(cè)其親本可能為NADC30和JXA1株，其中間重組區(qū)域與JXA1毒株高度同源，而兩端區(qū)域與NADC30毒株有較高的相似度。
　　2.PRRSV nsp2定量相互作用組學(xué)研究
　　利用SILAC結(jié)合IP實(shí)驗(yàn)的定量相互作用組學(xué)技術(shù)，在PRRSV感染的

6、條件下對(duì)與nsp2蛋白相互作用的蛋白進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，鑒定出9個(gè)病毒蛋白和62個(gè)宿主蛋白能夠與nsp2發(fā)生特異性互作，并利用IPA軟件對(duì)與nsp2互作的62個(gè)宿主蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，進(jìn)而生成了nsp2互作網(wǎng)絡(luò)圖。
　　在PRRSV感染和超表達(dá)條件下對(duì)病毒蛋白與nsp2之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)證實(shí)nsp2能夠與nsp1α、nsp1β和N發(fā)生相互作用，而nsp2與GP5只在病毒感染條件下有間接的相互作用

7、。同時(shí)，在PRRSV感染和超表達(dá)條件下對(duì)宿主蛋白與nsp2之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)證實(shí)nsp2能夠與YWHAB、YWHAZ和MARK2分別發(fā)生相互作用，而nsp2與vimentin只在病毒感染條件下有間接的相互作用。但是，有趣的是，通過(guò)實(shí)驗(yàn)Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了作為PRRSV受體之一的vimentin能夠與nsp2和N蛋白能夠形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，其中N蛋白起著橋梁的作用。在N蛋白的存在下，nsp2與vimentin蛋白能夠相互地發(fā)生