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文檔簡介
1、腦是人體的生命中樞器官,也是暴力損傷中極易受累的器官,因而腦挫傷是法醫(yī)學鑒定工作中常見的損傷類型。腦挫傷形成機制、腦挫傷時間推斷、腦挫傷程度判斷一直受法醫(yī)學工作者重視。由于國民經(jīng)濟高速發(fā)展,建筑業(yè)和交通運輸業(yè)的興起,創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生率在近幾年逐年增高,居創(chuàng)傷首位,是青壯年人群首要死亡原因。目前,關于腦挫傷轉(zhuǎn)歸機制尚不完全清楚,有許多理論學說,包括鈣離子超載、微循環(huán)障礙等學說,然而依據(jù)相應的理論學說研究出的治療方法鮮有可通過Ⅲ期臨床實驗
2、,應用于臨床治療。腦挫傷是法醫(yī)學工作中常見的損傷類型,推斷腦挫傷時間對刑事案件的偵查及審判具有重要意義,然而準確推斷腦挫傷時間一直是法醫(yī)學中的難題,至今尚未圓滿解決因此,有必要進一步研究腦挫傷的分子機理及找出相應的指標,為臨床診治和法醫(yī)鑒定提供理論依據(jù)。 材料與方法: 一、動物模型的制作,分組與對照 成年雄性SD大鼠50只,體重200-250g,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。隨機分為9組,每組5只,其中8組為實驗
3、組,1組為對照組,其余實驗組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法,制造大鼠腦挫傷模型。大鼠稱重后,乙醚吸入預麻醉,2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮,在人字縫前3mm,矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置,以30g重錘從25cm高處落下,打擊暴露的腦組織。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng),保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d和10d將大鼠麻醉
4、后脫頸椎處死,手術(shù)取出腦組織,沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分,一部分用于免疫組化染色,另一部分用于Western blot檢測。 二、免疫組織化學染色 腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作5μm厚度切片。采用鏈霉素—生物素法(SP法)進行免疫組化染色,并用蘇木素復染細胞核,具體步驟同試劑盒說明書。PSD—95抗體1:400稀釋,4℃孵育過夜。染色過程中另以PBS替代一抗,作為陰性對
5、照。同時進行常規(guī)HE染色。山羊抗大鼠PSD—95多克隆抗體購自北京博奧森公司,SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 三、Western blot檢測 提取腦組織蛋白并進行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印,5%脫脂牛奶封閉,一抗(1:200稀釋)、二抗(1:2500稀釋)孵育后,ECL顯色。實驗中以GAPDH為內(nèi)參。 實驗結(jié)果: 一、免疫組織化學染色結(jié)果 對照組神經(jīng)細胞胞
6、漿中可見少量PSD—95陽性染色。實驗組中,腦挫傷后3h,挫傷周邊區(qū)神經(jīng)細胞中陽性細胞數(shù)增多;傷后6h,陽性細胞數(shù)繼續(xù)升高;傷后12h組陽性細胞數(shù)與傷后6h組相似;傷后1d,PSD—95陽性細胞數(shù)下降;傷后3d,PSD—95陽性細胞數(shù)降至正常水平;傷后5d,陽性細胞數(shù)再次達到高峰;傷后7d,SD—95陽性細胞數(shù)開始減少;傷后10d,陽性細胞繼續(xù)減少。 二、Western blot結(jié)果 對照組僅見少量PSD—95的表達;挫
7、傷后3h—6h,出現(xiàn)PSD—95表達緩慢升高,12h達高峰,1d后下降,3d降至約正常水平,5d時又再次升高并達到高峰,以后逐漸下降。應用Fluorchem V2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均光密度值,經(jīng)統(tǒng)計分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論: 本實驗在建立大鼠腦挫傷模型的基礎上,應用免疫組織化學染色、Western blot方法檢測大鼠腦挫傷后PSD—95表達情況,結(jié)果表明: 1
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