凝集素富集糖肽聯(lián)合酶促18O3標記的定量N-糖蛋白組學方法在肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)研究中的應用.pdf

1、原發(fā)性肝癌位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位，死亡率第3位，占中國惡性腫瘤死亡率第2位。肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌最主要的組織學類型，約占所有原發(fā)性肝癌病例的70％～85％。手術(shù)切除是目前肝癌患者獲得治愈及長期生存的主要治療手段，但肝癌5年轉(zhuǎn)移復發(fā)率在接受根治性切除術(shù)后仍高于60％。因此，轉(zhuǎn)移復發(fā)是目前影響肝癌患者總生存率的主要問題;解決此問題需兩方面的工作，一是明確轉(zhuǎn)移復發(fā)的分子機制，

2、二是尋找合適的預測預后、指導個體化治療的生物標志物(Biomarker)。盡管研究者在基因組和蛋白質(zhì)組領(lǐng)域已做了很多工作，但至今并未得到非常滿意的結(jié)果。
　　蛋白的糖基化是重要的翻譯后修飾，是蛋白質(zhì)成熟并獲得生物學功能的關(guān)鍵步驟。大多數(shù)分泌性蛋白和幾乎所有的免疫相關(guān)蛋白都是糖蛋白;糖蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生過程中參與細胞惡性轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導，提示病灶周圍的微環(huán)境變化，與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移亦緊密相關(guān)，因此很多已知的癌相關(guān)生物標志物也都是糖

3、蛋白，如AFP、CEA、CA125和PSA等;由此可見，糖蛋白組學在腫瘤研究中具有重要而獨特的地位。目前很多研究表明糖蛋白不僅可能成為肝癌診斷和轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的分子標記物，也有能力成為有效的治療靶點。
　　基于以上的理論背景，本研究在近年來糖蛋白富集、標記和分析技術(shù)最新進展的基礎(chǔ)上，擬針對目前糖蛋白組學研究的部分不足，建立了一個整體性的研究策略;應用凝集素(Lectin)層析純化得到不同糖鏈類型的蛋白樣本，聯(lián)合固化胰蛋白酶(Immo

4、bilized Trypsin)及肽N-糖苷酶F(PNGase F)進行序貫18O標記，將不同糖型的配對蛋白樣本以質(zhì)譜進行相對定量，而且建立基于MascotDistiller軟件的自建算法，自動化處理定量數(shù)據(jù)，最終能夠全面研究復雜生物樣本中的不同糖鏈結(jié)構(gòu)類型的糖蛋白改變。將所建立的研究策略進一步應用到接受根治性切除術(shù)的早期HCC患者（BCLC0-A期）中;對其術(shù)前血清中N-糖蛋白，按不同糖型富集分類，進行定量糖蛋白質(zhì)組學研究，尋找與術(shù)后

5、轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的特定糖鏈結(jié)構(gòu)的N-糖蛋白，探討這些糖蛋白作為HCC預后相關(guān)的分子標記物的可能性，為肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)的預測和干預治療提供特異的糖標志物和治療靶點;并為今后研究這些糖蛋白糖基化在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，提供一個有用的工具。
　　第一部分凝集素富集糖肽聯(lián)合酶促18O3標記的定量N-糖蛋白組學方法的建立和初步驗證
　　目的:糖蛋白組學在腫瘤研究中具有顯著意義。最近一些串聯(lián)18O3標記技術(shù)被引入糖蛋白相對定量研究中

6、，但均局限于對總糖蛋白或總糖鏈的研究，未關(guān)注到特定糖蛋白的糖鏈類型改變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，且這些新18O3標記技術(shù)缺乏成熟的定量軟件支持，數(shù)據(jù)分析繁瑣費時。本實驗針對上述不足，建立一種凝集素層析聯(lián)合酶促18O3穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，結(jié)合自建的定量算法支持，從而構(gòu)成一個整合性的N-糖蛋白組學定量研究策略。
　　方法:將標準糖蛋白轉(zhuǎn)化酶(Invertase)和胎球蛋白(Fetuin)酶解后，以ConA Lectin層析，配對樣本

7、以Immobilized Trypsin和PNGase F分別進行18O/16O穩(wěn)定同位素標記，標記后的配對樣本按1∶10-10∶1的不同比例混合后，以LC-ESI-MS/MS檢測。首先手工處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定本方法的線性和準確性;并與自建算法所得數(shù)據(jù)對比，驗證自建算法的可靠性。將此定量研究策略應用于3例HCC患者和3例健康對照組間，分別以ConA、WGA和LCH層析臨床血清樣本，得到帶有3種特異糖型的亞組糖蛋白，將HCC患者和健康人的同

8、一類型亞組進行定量糖蛋白組學研究，對部分差異蛋白進行Western blot驗證，以在實際臨床樣本中進一步檢驗本策略的可靠性和可行性。
　　結(jié)果:在標準糖蛋白中，本方法保持足夠的準確性和可重復性，在1∶10-10∶1的范圍內(nèi)保持線性，糖肽和糖蛋白數(shù)據(jù)的線性相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient，r2）均＞0.99。以基于Mascot Distiller軟件的自建算法分析數(shù)據(jù)，所得結(jié)果與理論值及手工計算結(jié)果非常接近

9、，同樣保持足夠的準確性和線性。SD值介于0.023-0.186之間（糖肽）及0.075-0.216之間（糖蛋白）。在對正常人和肝癌患者的ConA、LCH和WGA3類亞組血清糖蛋白的分別對比和定量分析中，一共確定了有43種糖肽、35種糖蛋白發(fā)生了不同程度的改變，其中有14種糖肽和13種糖蛋白同時在3個亞組中發(fā)生不同程度的改變。手工驗證和Western blot結(jié)果進一步證實了本方法對于實際臨床樣本定量分析的可靠性。
　　結(jié)論:凝集素

10、層析富集糖蛋白聯(lián)合酶促18O3穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，結(jié)合自建算法的自動化分析，是一種整合性的N-糖蛋白標記和定量方法，具有較好的準確性和可重復性;能夠?qū)⑻擎滎愋透淖兒吞堑鞍棕S度改變結(jié)合起來，且可以應用于臨床復雜樣本的處理分析，是一種較好的糖蛋白組學研究策略。
　　第二部分凝集素富集糖肽聯(lián)合酶促18O3標記的定量N-糖蛋白組學方法在肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)研究中的應用
　　目的:本研究應用自建的凝集素層析富集糖肽聯(lián)合酶促18O3標記

11、的定量N-糖蛋白組學研究策略，以接受根治性切除術(shù)的HCC患者為研究對象，對其術(shù)前血清中N-糖蛋白進行研究，尋找HCC患者血清中與術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的具有特征性糖鏈類型的N-糖蛋白，探討其作為轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)“糖標志物”的可能性。
　　方法:在40例早期HCC患者（BCLC0-A期）構(gòu)成的癌與癌旁組織配對的樣本群中，利用凝集素芯片(Lectin microarray)和糖蛋白膠上染色技術(shù)，分別比較復發(fā)和無復發(fā)組HCC患者的癌與癌旁組織，初

12、步確定與HCC轉(zhuǎn)移復發(fā)密切相關(guān)的特征性糖鏈改變及與之對應的凝集素種類。在另一早期HCC患者血清樣本群中，按術(shù)后隨訪有無轉(zhuǎn)移復發(fā)分別選取兩組共40例（每組20例），根據(jù)上步實驗選擇凝集素ConA、LCH、WGA，利用第一部分研究所建立的整合性N-糖蛋白組學定量研究策略，分別以親水層析及凝集素層析富集糖肽聯(lián)合酶促18O3標記，進行定量N-糖蛋白組學比較分析，篩選出血清中與轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的，特征性糖鏈類型的糖蛋白改變。在共計60例早期HCC患者

13、血清的獨立樣本群中，對部分差異糖蛋白進行Western blot驗證，統(tǒng)計學分析其對預后和轉(zhuǎn)移復發(fā)的預測價值，單因素和多因素Cox回歸分析其與HCC患者術(shù)后復發(fā)的關(guān)系及是否為獨立預測因素，最后在肝癌細胞系中進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)。
　　結(jié)果:在對早期HCC患者癌及癌旁組織進行的凝集素芯片與糖蛋白膠上染色研究中，發(fā)現(xiàn)多個Lectin所對應的糖鏈類型，在復發(fā)與無復發(fā)組間存在差異。以其中3種Lectin層析HCC患者血清糖蛋白進行標記及定量

14、研究后，發(fā)現(xiàn)有44個糖蛋白在總糖蛋白組及ConA、LCH和WGA富集的特異性糖鏈類型的亞糖蛋白組中，發(fā)生豐度改變，其中16個糖蛋白同時在多個亞糖蛋白組/總糖蛋白組發(fā)生不同的豐度改變。選擇MASP1、QSOX1、Ceru、LG3BP和Thrombin蛋白進行Western blot驗證，結(jié)果提示血清中LCH富集的QSOX1糖蛋白（即帶有α-1，6巖藻糖基化的QSOX1蛋白），其表達水平在未復發(fā)組顯著高于復發(fā)組，以中位數(shù)為界值分析其與HCC

15、術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)及總生存的相關(guān)性，單因素及多因素分析均發(fā)現(xiàn)其表達與至復發(fā)時間(TTR)顯著負相關(guān)（單因素:HR=0.452，95％CI=0.211-0.972,p=0.042;多因素:HR=0.458,95％CI=0.213-0.988,p=0.047），與總生存(OS)無關(guān)。在肝癌細胞系中的初步驗證表明，QSOX1表達隨細胞系轉(zhuǎn)移潛能的升高而降低，是保護性因子。
　　結(jié)論:早期HCC患者術(shù)前血清中，存在與轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的具有特征性糖鏈

16、類型的糖蛋白;血清中帶有α-1，6巖藻糖基化的QSOX1蛋白，其表達水平與早期HCC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)密切負相關(guān)，是預測早期HCC患者根治術(shù)后復發(fā)的糖分子標簽。QSOX1蛋白在肝癌細胞系中表達，且其表達隨肝癌細胞系轉(zhuǎn)移潛能的升高而降低，是潛在的抑癌分子。
　　結(jié)論
　　1.凝集素層析富集糖肽聯(lián)合酶促18O3穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，結(jié)合自建算法的自動化分析，是一種整合性的N-糖蛋白標記和定量方法，具有較好的準確性和可重復性;能夠?qū)⑻?/p>

17、鏈類型改變和糖蛋白豐度改變結(jié)合起來，且可以應用于臨床復雜樣本的處理分析，是一種高通量的N-糖蛋白組定量比較的研究策略。
　　2.基于Mascot Distiller軟件的自建算法，能夠為18O3穩(wěn)定同位素標記的數(shù)據(jù)分析，提供快速、準確及可靠的結(jié)果，可以替代繁瑣費時的手工計算，為臨床樣本的高通量分析提供支持。
　　3.早期HCC患者術(shù)前血清中LCH富集的α-1，6巖藻糖基化的QSOX1蛋白，其表達水平與早期HCC患者的復發(fā)負相

18、關(guān)，是預測早期HCC患者根治術(shù)后復發(fā)的糖分子標簽。
　　4.QSOX1蛋白在肝癌細胞系中表達，且其表達隨肝癌細胞系轉(zhuǎn)移潛能的升高而明顯降低，是潛在的轉(zhuǎn)移抑制分子。
　　創(chuàng)新點
　　1.建立了新的凝集素層析聯(lián)合酶促18O3穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，并證實其具有良好的準確性和可重復性，能夠用于臨床復雜生物樣本的研究。
　　2.建立了新的基于Mascot Distiller軟件的自建算法，可以替代手工計算，為18O3穩(wěn)定同位

19、素標記提供準確可靠的結(jié)果。
　　3.首次報道了α-1，6巖藻糖基化的QSOX1蛋白與早期HCC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)密切相關(guān)，可能成為臨床預測HCC術(shù)后復發(fā)的分子標簽。
　　4.首次報道了QSOX1蛋白在肝癌細胞系中的表達隨轉(zhuǎn)移潛能的升高而明顯降低，是潛在的轉(zhuǎn)移抑制分子。
　　潛在應用價值
　　1.外周血中α-1，6巖藻糖基化QSOX1的表達水平可預測接受根治手術(shù)的早期HCC患者的預后。
　　2.對α-1，6巖藻