基于CRISPR-Cas9的Wnt信號調(diào)控系統(tǒng)及其在提高M(jìn)SCs心肌損傷修復(fù)能力中的價值.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建基于CRISPR/Cas9的Wnt信號通路調(diào)控病毒系統(tǒng)；探討該調(diào)控系統(tǒng)對MSCs向成纖維、成血管、成肌等方向分化的調(diào)控；尋找能夠提高M(jìn)SC治療心肌損傷的策略。
　　方法：
　　（1）基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建精準(zhǔn)調(diào)控Wnt信號通路的表達(dá)載體及其驗證效果
　　選取Wnt信號中負(fù)性調(diào)控分子，設(shè)計并合成能夠表達(dá)靶向上述分子gRNA的互補(bǔ)DNA克隆序列，BsmBI限制性內(nèi)切酶酶切載體后，采用分子克

2、隆的方法將上述序列克隆至目的載體lenti-sgRNA-Ms2-zeo，測序正確的克隆通過Lipofectamine2000與lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)。
　　（2）基于CRISPR/Cas9的Wnt信號通路調(diào)控病毒系統(tǒng)對MSCs分化命運的影響。
　　選取Wnt信號中負(fù)性調(diào)控

3、分子的表達(dá)載體，通過Lipofectamine2000與psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集病毒并過濾，通過polybrene感染小鼠MSCs，感染72h后抗生素篩選，體外擴(kuò)增，7天后，qRt-PCR檢測各目的基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建精準(zhǔn)調(diào)控Wnt信號通路的表達(dá)載體及其驗證效果。
　　篩選了Wnt信號通路中已知的19個負(fù)性調(diào)控基因；針對每個基因設(shè)計了兩

4、對gRNA序列，并構(gòu)建了能夠表達(dá)gRNA和MS2融合序列的載體，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的 DNA序列與預(yù)期完全相符。隨機(jī)挑選了4個表達(dá)載體與lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞，qPCR結(jié)果顯示構(gòu)建的目的載體聯(lián)合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine載體可以協(xié)同促進(jìn)靶分子表達(dá)。
　?。?）基于CR

5、ISPR/Cas9的Wnt信號通路調(diào)控病毒系統(tǒng)對MSCs分化命運的影響。
　　慢病毒感染MSCs3天后，進(jìn)行抗生素篩選，體外擴(kuò)增后qPCR結(jié)果顯示實驗組VEGF、α-SMA、Col1a1均不同程度低于對照組（p<0.05）。Western blot結(jié)果觀察到與對照組β-actin相比較α-SMA、Col1a1均不同程度降低。
　　結(jié)論：
　　1.本研究構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的、可以精確調(diào)控Wnt信