CRISPR-Cas9系統(tǒng)在擬南芥eIF2α基因沉默中的應(yīng)用及玉米載體構(gòu)建的優(yōu)化改造.pdf

1、近幾年，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的物種基因組測(cè)序工作也相繼完成，基因功能研究作為后基因時(shí)代的主要任務(wù)，在該領(lǐng)域不斷向前推進(jìn)的同時(shí)，相關(guān)的技術(shù)手段取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。其中，基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，可為基因功能研究提供基因敲除的突變體材料，是理想的基因功能研究方法?；蚪M定點(diǎn)編輯技術(shù)包括:鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like e

2、ffector nuclease，TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated system9)。
　　ZFNs是最先被發(fā)展的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，由于ZFNs設(shè)計(jì)和篩選十分困難，并且脫靶效應(yīng)往往會(huì)造成細(xì)胞毒害，這些因素使其應(yīng)用受到限制。后來，基因編輯技術(shù)發(fā)展出新的技術(shù)，即轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)因子

3、核酸酶(TALENs)，在理論上可以獲得任意靶位點(diǎn)的序列，但是該體系的組裝和篩選需要大量的測(cè)序工作，花費(fèi)較高。目前，基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9作為一種新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)逐漸被應(yīng)用于動(dòng)植物的基因敲除，該系統(tǒng)基因操作效率高、方法簡(jiǎn)便，在大大降低脫靶效應(yīng)的同時(shí)還能保證高效、特異的位點(diǎn)切割。以上三種方法在導(dǎo)致基因雙鏈斷裂后激活自身的損傷基因修復(fù)機(jī)制:同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)，介導(dǎo)基因序列的插入、缺失或置換，引起基因突變。

4、r>　　本研究主要通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)擬南芥eIF2α基因和玉米HLH、BRD基因進(jìn)行編輯，獲得目的基因突變體，進(jìn)而研究基因功能。同時(shí)，構(gòu)建和優(yōu)化CRISPR/Cas9的玉米表達(dá)載體，為玉米的轉(zhuǎn)基因與進(jìn)一步的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　在擬南芥中，eIF2α蛋白激酶在響應(yīng)逆境脅迫時(shí)起著重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)目的基因eIF2α家族的兩個(gè)成員進(jìn)行定點(diǎn)敲除。本課題組對(duì)該基因家族的兩個(gè)成員分

5、別按照PAM原則設(shè)計(jì)了特異的gRNA(Guided RNA)，序列長(zhǎng)度為20bp，分別識(shí)別at2g40290、at5g05470兩個(gè)基因的特異靶位點(diǎn)，并將這兩個(gè)gRNA命名為2gⅡ-gRNA、5gⅢ-gRNA。對(duì)兩基因家族成員進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)有一段20bp長(zhǎng)度的高度保守同源序列，3'端符合NGG的結(jié)構(gòu)，以該序列為靶基因識(shí)別序列設(shè)計(jì)gRNA，我們將其命名為gⅠ-gRNA，以達(dá)到在同一植株體內(nèi)同時(shí)敲除兩個(gè)基因的目的。但5'端沒有C或G，

6、試驗(yàn)實(shí)際操作過程中合成gRNA引物時(shí)人為在5'端加了一個(gè)堿基G，保證gRNA的穩(wěn)定性。將合成的gRNA引物與Cas9載體及1300載體依次連接，獲得3個(gè)完整的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法獲得轉(zhuǎn)化擬南芥植株，利用抗生素和基因型鑒定分別篩選到gⅠ-gRNA、2gⅡ-gRNA、5gⅢ-gRNA的陽性突變體。
　　在玉米中，有研究報(bào)告顯示，玉米葉夾角的大小對(duì)生物產(chǎn)量有著直接影響，并且該性狀受基因HLH和BRD的調(diào)

7、控。本研究對(duì)CRISPR/Cas9原始載體啟動(dòng)子和終止子針對(duì)玉米的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行了優(yōu)化，ZmU3啟動(dòng)子啟動(dòng)gRNA的表達(dá)，而Cas9的啟動(dòng)子和終止子由原來的pAtUBQ和tAtUBQ替換成了pOsUBQ和OCS，以提高在玉米中的表達(dá)。靶基因選擇HLH和BRD兩個(gè)葉夾角相關(guān)基因，進(jìn)行g(shù)RNA的設(shè)計(jì)和CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建。除此之外，為了使載體能夠融合多個(gè)基因的gRNA，我們對(duì)載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化改造，添加了PmeⅠ、PacⅠ、