一種新型的細(xì)菌體內(nèi)CRISPR-Cas9檢測(cè)系統(tǒng)的建立及其活性鑒定.pdf

1、目的：
　　CRISPR/Cas9是一種新型的基因編輯技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單、可對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，但存在一定的脫靶性，有待深入探討。本論文通過(guò)建立一種不受序列限制且酶切連接反應(yīng)一步進(jìn)行的分子克隆方法，構(gòu)建Cas9蛋白在大腸埃希菌和恥垢分枝桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建在恥垢分枝桿菌中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白和mCherry熒光蛋白的質(zhì)粒；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建一種在細(xì)菌體內(nèi)通過(guò)同源重組和具有同源臂的熒光報(bào)告基因mCherry對(duì)Cas

2、9蛋白及不同的guide RNA設(shè)計(jì)對(duì)靶標(biāo)序列的切割效率、脫靶效應(yīng)等的檢測(cè)系統(tǒng)。為后續(xù)深入研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)、guide RNA的設(shè)計(jì)及其生物學(xué)應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)含有甲基化位點(diǎn)的引物，PCR目的基因和載體。將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行純化，目的片段與載體PCR產(chǎn)物取相同摩爾數(shù)混合；利用識(shí)別甲基化C的 FspEⅠ內(nèi)切酶，向混合均勻的PCR產(chǎn)物中加入T4 DNA連接酶、FspEⅠ內(nèi)切酶、a

3、ctivator、FspEⅠ內(nèi)切酶buffer，以及ATP混勻，快速構(gòu)建重組質(zhì)粒pTac-Cas9、pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及 pMV261-mCherry。分別將重組質(zhì)粒 pTac-Cas9轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α；pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2以及pMV261-mCherry轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌，利用Western-blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)活性。
　　2.通過(guò)在熒光報(bào)告基因mCherr

4、y的ORF中插入了guide RNA的靶標(biāo)序列，并在靶標(biāo)序列的兩側(cè)預(yù)留了不同長(zhǎng)度的上下游同源編碼區(qū),利用Cas9蛋白切割，被隔開(kāi)的mCherry基因通過(guò)同源重組的方式進(jìn)行自我修復(fù)，用肉眼直接觀察是否出現(xiàn)紅色菌落判斷其修復(fù)功能。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了與靶標(biāo)序列互補(bǔ)長(zhǎng)度不同的guide RNA以及向guide RNA添加與靶標(biāo)序列不配對(duì)的堿基進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)，利用抗性平板篩選，最后通過(guò)紅色菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，用SPSS軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：

5、r>　　1.利用FspEⅠ內(nèi)切酶和T4連接酶一步反應(yīng)的分子克隆方法，成功構(gòu)建了在大腸埃希菌DH5α的表達(dá)質(zhì)粒pTac-Cas9，測(cè)序鑒定正確, Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示Cas9蛋白在DH5α中表達(dá)成功；此外，利用該技術(shù)構(gòu)建了可在分枝桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒 pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及pMV261-mCherry，并在恥垢分枝桿菌中成功表達(dá)ClpC2和mCherry蛋白，但pMV261-Cas9轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌

6、不成功，原因有待進(jìn)一步研究。
　　2.通過(guò)在熒光報(bào)告基因mCherry的ORF中插入了guide RNA的靶標(biāo)序列，并在靶標(biāo)序列的兩側(cè)預(yù)留了不同長(zhǎng)度的上下游同源編碼區(qū)，通過(guò)Cas9蛋白切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有同源區(qū)域的質(zhì)粒被切割后無(wú)紅色菌落。而包含42bp、78bp、136bp同源區(qū)的質(zhì)粒被Cas9切割后可以有效重組，經(jīng)過(guò)紅色菌落計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)具有相似的重組效率；與靶標(biāo)序列互補(bǔ)長(zhǎng)度不同的guide RNA，結(jié)果顯示配對(duì)區(qū)域?yàn)?9bp具有最高

7、的切割效率，20bp次之，其他長(zhǎng)度效率依次降低；向guide RNA添加與靶標(biāo)序列不配對(duì)的堿基進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)guide RNA相比靶標(biāo)序列突變的堿基位置位于倒數(shù)第二位或第六位（5′-3′）仍能被Cas9切割，出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了一種不受序列限制、酶切連接反應(yīng)一步進(jìn)行的分子克隆方法，構(gòu)建了在大腸埃希菌DH5α中的表達(dá)質(zhì)粒pTac-Cas9、分枝桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒pMV261-Cas9、pMV261-