RB基因與TSC2基因介導的協(xié)同效應對血管平滑肌細胞增殖的調控機制研究.pdf

1、目的:血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的無序增殖是血管重塑后發(fā)生再狹窄的重要因素。RB/E2F通路系統(tǒng)和mTOR信號通路系統(tǒng)與細胞周期的調控和細胞的增殖有著密切的聯(lián)系，RB和TSC2基因分別是兩條通路的核心調控基因。本研究探索RB/E2F與mTOR信號通路系統(tǒng)與VSMC增殖過程的相關性;探索RB與TSC2基因雙敲除后介導的協(xié)同效應對細胞增殖的抑制作用;探索活性氧自由基(ROS)是否為RB

2、與TSC2基因雙敲除介導的協(xié)同效應引起細胞增殖停止的機制。
　　方法:1，體外培養(yǎng)VSMC，并施加血小板源性生長因子(PDGF-BB)干預，模擬VSMC在體內的增殖表型。2，運用RT-PCR，Wertern-Blot法檢測施加PDGF-BB干預前后，RB/E2F和TSC2/mTOR通路系統(tǒng)靶基因表達水平的變化情況。3，慢病毒轉染RB及TSC2基因，應用MTT法分別檢測空載慢病毒組(為空載體對照組)、RB基因單獨敲除組、TSC2基因

3、單獨敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的細胞增殖水平。4，Brdu染色分別檢測對照組、RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的DNA合成水平。5，檢測對照組、RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組ROS表達水平。6，施加NAC(氧自由基清除劑)干預后，應用MTT法分別檢測對照組、RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的細胞增殖水平。
　

4、　結果:1，在施加PDGF-BB影響因子后，RB/E2F信號系統(tǒng)的下游靶基因CCNA2和CDK1表達水平增加了8倍，mTOR信號通路系統(tǒng)的下游基因s6k的蛋白表達水平有明顯的升高。
　　2，RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組的細胞增殖水平較對照組有明顯提高，而RB/TSC2基因雙敲除組的細胞增殖水平較對照組則出現明顯的降低。
　　3，RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組的DNA合成水平較對照組有明顯提高，而RB

5、/TSC2基因雙敲除組的DNA合成水平較對照組則出現顯著的降低。
　　4，RB/TSC2基因雙敲除組ROS表達水平顯著高于對照組，而對照組、RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組的ROS水平相差不大。
　　5，RB/TSC2基因雙敲除組的增殖水平在施加NAC干預后顯著回升，與對照組(空載慢病毒組)、RB基因單獨敲除組、TSC2基因單獨敲除組的增殖水平相差不大。
　　結論:本研究發(fā)現，RB/E2F和mTOR信號通路系