RB基因與TSC2基因介導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)對血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的無序增殖是血管重塑后發(fā)生再狹窄的重要因素。RB/E2F通路系統(tǒng)和mTOR信號通路系統(tǒng)與細(xì)胞周期的調(diào)控和細(xì)胞的增殖有著密切的聯(lián)系，RB和TSC2基因分別是兩條通路的核心調(diào)控基因。本研究探索RB/E2F與mTOR信號通路系統(tǒng)與VSMC增殖過程的相關(guān)性;探索RB與TSC2基因雙敲除后介導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)對細(xì)胞增殖的抑制作用;探索活性氧自由基(ROS)是否為RB

2、與TSC2基因雙敲除介導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)引起細(xì)胞增殖停止的機(jī)制。
　　方法:1，體外培養(yǎng)VSMC，并施加血小板源性生長因子(PDGF-BB)干預(yù)，模擬VSMC在體內(nèi)的增殖表型。2，運(yùn)用RT-PCR，Wertern-Blot法檢測施加PDGF-BB干預(yù)前后，RB/E2F和TSC2/mTOR通路系統(tǒng)靶基因表達(dá)水平的變化情況。3，慢病毒轉(zhuǎn)染RB及TSC2基因，應(yīng)用MTT法分別檢測空載慢病毒組(為空載體對照組)、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因

3、單獨(dú)敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的細(xì)胞增殖水平。4，Brdu染色分別檢測對照組、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的DNA合成水平。5，檢測對照組、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組ROS表達(dá)水平。6，施加NAC(氧自由基清除劑)干預(yù)后，應(yīng)用MTT法分別檢測對照組、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組、RB/TSC2基因雙敲除組的細(xì)胞增殖水平。
　

4、　結(jié)果:1，在施加PDGF-BB影響因子后，RB/E2F信號系統(tǒng)的下游靶基因CCNA2和CDK1表達(dá)水平增加了8倍，mTOR信號通路系統(tǒng)的下游基因s6k的蛋白表達(dá)水平有明顯的升高。
　　2，RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組的細(xì)胞增殖水平較對照組有明顯提高，而RB/TSC2基因雙敲除組的細(xì)胞增殖水平較對照組則出現(xiàn)明顯的降低。
　　3，RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組的DNA合成水平較對照組有明顯提高，而RB

5、/TSC2基因雙敲除組的DNA合成水平較對照組則出現(xiàn)顯著的降低。
　　4，RB/TSC2基因雙敲除組ROS表達(dá)水平顯著高于對照組，而對照組、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組的ROS水平相差不大。
　　5，RB/TSC2基因雙敲除組的增殖水平在施加NAC干預(yù)后顯著回升，與對照組(空載慢病毒組)、RB基因單獨(dú)敲除組、TSC2基因單獨(dú)敲除組的增殖水平相差不大。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)，RB/E2F和mTOR信號通路系