BDNF-TrkB通路對前列腺癌細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、失巢凋亡的影響及分子機制的體外研究.pdf

1、第一部分人前列腺細胞失巢凋亡耐受模型的建立及其生物學(xué)特性的研究
　　目的:建立人前列腺癌細胞失巢凋亡耐受模型，觀察其生物學(xué)特性的改變。
　　方法:Western blot及qRT-PCR檢測前列腺癌細胞系LNCaP，PC3，PC3M，DU145的TrkB（受體酪氨酸激酶B）及其配體BDNF（腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子）表達情況。隨后我們選擇PC3，DU145細胞進行失巢凋亡耐受模型的建立。PC3，DU145細胞在ULC培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)

2、7天后，將細胞重新貼壁培養(yǎng)，待細胞擴增后，再將細胞轉(zhuǎn)入ULC培養(yǎng)板繼續(xù)懸浮培養(yǎng)7天后，存活的細胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，以誘導(dǎo)獲得失巢凋亡耐受PC3，DU145細胞。Transwell實驗及軟瓊脂克隆形成實驗分別檢測親本細胞及失巢凋亡耐受細胞的遷移、侵襲及錨定非依賴性生長能力。Western Blot及Real-Time PCR檢測親本細胞及失巢凋亡耐受細胞TrkB和BDNF表達水平的變化。
　　結(jié)果:1.上述所有前列腺癌細胞系均表達Trk

3、B，除了LNCaP細胞不表達BDNF外，其余前列腺癌細胞均表達BDNF。
　　2.失巢凋亡耐受PC3，DU145細胞的遷移、侵襲及錨定非依賴性生長能力均顯著高于親本細胞。
　　3.失巢凋亡耐受PC3，DU145細胞的TrkB mRNA及蛋白表達水平明顯高于親本細胞，而BDNF mRNA及蛋白表達水平無明顯差異。
　　結(jié)論:前列腺癌細胞系表達不同水平的TrkB及BDNF。采用ULC培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)后重貼壁的方法成功構(gòu)建出失

4、巢凋亡耐受前列腺癌細胞。誘導(dǎo)獲得的失巢凋亡耐受PC3，DU145細胞的錨定非依賴性生長、遷移和侵襲能力均顯著高于親本細胞，并且其TrkB表達水平明顯升高。
　　第二部分 BDNF/TrkB通路對人前列腺癌細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡的影響的體外研究
　　目的:研究BDNF/TrkB通路對不同前列腺癌細胞系上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡的影響。
　　方法:用siRNA敲低失巢凋亡耐受細胞TrkB的表達，

5、采用流式細胞術(shù)及Transwell小室實驗觀察細胞遷移、侵襲及抗失巢凋亡能力的變化。采用流式細胞術(shù)及Transwell小室實驗評估rhBDNF及酪氨酸激酶受體拮抗劑K252a對不同前列腺癌細胞失巢凋亡、遷移、侵襲的影響。使PC3細胞穩(wěn)定過表達TrkB，采用流式細胞術(shù)、CCK-8、軟瓊脂克隆形成實驗以及Transwell小室實驗評估轉(zhuǎn)染細胞抗失巢凋亡能力、非錨定依賴性生長能力以及遷移、侵襲能力的變化，倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)學(xué)改變。

6、
　　結(jié)果:1.用siRNA敲低TrkB的表達后，能抑制失巢凋亡耐受前列腺癌細胞的遷移、侵襲及抗失巢凋亡能力。
　　2.外源性BDNF的刺激能促進前列腺癌細胞的遷移、侵襲，抑制前列腺癌細胞的失巢凋亡，而酪氨酸激酶受體拮抗劑K252a能抑制上述作用。
　　3.穩(wěn)定過表達TrkB能抑制PC3細胞失巢凋亡，促進PC3細胞錨定非依賴性生長，促進血清誘導(dǎo)或BDNF誘導(dǎo)的PC3細胞遷移、侵襲，以及使PC3細胞形態(tài)發(fā)生上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

7、樣改變。
　　結(jié)論:BDNF/TrkB通路能介導(dǎo)前列腺癌細胞EMT的發(fā)生、抑制前列腺癌細胞的失巢凋亡、促進前列腺癌細胞遷移及侵襲。BDNF/TrkB通路參與了多階段的前列腺癌進展過程，并在其中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 BDNF/TrkB通路介導(dǎo)前列腺癌細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的分子機制的研究
　　目的:研究BDNF/TrkB通路介導(dǎo)前列腺癌細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的

8、分子機制。
　　方法:1.比較親本細胞及失巢凋亡耐受前列腺癌細胞AKT及ERK通路激活情況，用siRNA敲低失巢凋亡耐受前列腺癌細胞TrkB表達，觀察AKT及ERK通路激活情況。
　　2.以外源性BDNF及K252a為處理因素，Western Blot檢測不同處理因素對前列腺癌細胞AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、MMP9蛋白表達的影響，以及對懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3蛋白表達的影響。
　　3

9、. Western Blot檢測穩(wěn)定過表達TrkB的PC3細胞的AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、Slug、MMP9蛋白表達的變化，以及在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3蛋白表達的變化。
　　4.觀察AKT拮抗劑MK2206對BDNF/TrkB通路介導(dǎo)的前列腺癌細胞遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的影響。
　　結(jié)果:1. AKT

10、及ERK通路在失巢凋亡耐受前列腺癌細胞中被顯著激活，而瞬時敲低失巢凋亡耐受前列腺癌細的TrkB表達能抑制AKT及ERK通路的激活，并促進懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生。
　　2.外源性BDNF的刺激能上調(diào)前列腺癌細胞p-AKT、p-ERK、MMP9的表達水平，抑制懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生，而K252a能抑制上述作用。
　　3. PC3細胞穩(wěn)定過表達TrkB后，其p-AKT、p

11、-ERK、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、MMP9的表達水平上調(diào)，E-cadherin表達水平下降，懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生減少。
　　4. AKT抑制劑MK2206能抑制BDNF/TrkB通路介導(dǎo)的前列腺癌細胞遷移、侵襲及失巢凋亡耐受。
　　結(jié)論: BDNF/TrkB通路通過調(diào)節(jié)多種蛋白表達從而介導(dǎo)前列腺癌細胞EMT發(fā)生，抑制前列腺癌細胞的失巢凋亡，及促進前列腺癌