細菌GIsul2基因島的轉移與調(diào)控機制研究.pdf

1、基因水平轉移(Horizontal gene transfer,HGT)可導致細菌不同種屬間個體DNA的交換，從而使細菌對環(huán)境的適應性增強，是細菌進化的重要途徑之一?；驆u(Genomic Islands，GEIs)是基因水平轉移的重要載體?？梢苿拥幕驆u能夠整合到宿主的染色體上，并在特定的條件下切除，進而通過轉化、接合或轉導等方式轉移到新的宿主中，是非?；钴S的移動元件?；驆u具有多種生物學功能，如抗生素抗性、致病性、異源物質(zhì)降解及重金

2、屬抗性等?；驆u的轉移不僅有助于微生物對外界環(huán)境的適應，而且能夠造成可變基因在不同種屬細菌間的廣泛傳播，如基因島攜帶的毒力和耐藥基因的傳播導致了致病性的多重耐藥細菌的產(chǎn)生，嚴重威脅人類健康。
　　本研究中所涉及的GIsul2基因島在陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae subspecies)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)和志賀桿菌（Shigella flexneri）中都有發(fā)現(xiàn)報道

3、。其中GIsul2基因島不僅攜帶了多重耐藥基因和砷抗性基因而且在GIsul2基因島的尾端存在一個ISCR2移動元件。已有研究表明，ISCR家族移動元件與耐藥基因的傳播是存在聯(lián)系的，但其轉移調(diào)控機制仍未闡明，亟待研究。本文對細菌中GIsul2基因島的結構特點、轉移和調(diào)控機制進行了深入的研究，揭示了GIsul2基因島的轉移和初步的調(diào)控分子機制，為遏制基因島的傳播提供重要策略。
　　研究目的:
　　本文以GIsul2基因島為研究對

4、象，利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)研究該基因島在移動過程中可能存在的轉移及調(diào)控機制，探究GIsul2基因島對細菌耐藥基因傳播的影響。通過對GIsul2基因島轉移調(diào)控因子功能的進一步研究，進而找到抑制基因島的轉移的手段。從細菌水平基因轉移和基因調(diào)控的角度深入研究病原菌致病性、耐藥性和傳播性的進化機制，為解決細菌耐藥性問題提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.以實驗室測序的Shigella flexneri51575為研究對象，通過分子克

5、隆手段獲得大小為15kb的GIsul2基因島。
　　2.構建溫敏供體質(zhì)粒pKD46-GIsul2以及相關基因敲除型供體質(zhì)粒，同時構建相關受體pKF18-GMP800。
　　3.將供受體質(zhì)粒轉化進大腸桿菌感受態(tài)DH5α(recA-)，構建雙質(zhì)粒系統(tǒng)檢測GIsul2基因島轉移情況。
　　4.將GIsul2基因島中關鍵基因通過分子克隆手段構建最小轉移單元，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，研究相關因子的相互作用。
　　5.將引起GIsu

6、l2基因島轉移的關鍵蛋白P4-like整合酶通過PCR的方式克隆到原核蛋白表達載體pET28a載體上，將構建成功的克隆轉化進BL21(DE3)感受態(tài)中，使用His標簽蛋白純化試劑盒純化P4-like整合酶。設計體外實驗驗證P4-like整合酶的功能。
　　研究結果:
　　1.通過PCR、酶切和測序等手段檢測到GIsul2基因島的轉移，并且GIsul2基因島在轉移的同時能夠介導ISCR2單元的轉移。
　　2.基因敲除實驗

7、結果表明，P4-like整合酶及基因島邊界的正向重復序列(direct repeats，DRs)對GIsul2基因島以及ISCR2單元的轉移是必須的。
　　3.GIsul2基因島在轉移過程中存在fitA、alpa等輔助因子，這些輔助因子能夠調(diào)控GIsul2基因島及ISCR2單元轉移頻率和轉移形式。
　　4.將P4-like整合酶與DR區(qū)序列通過PCR手段構建最小移動單元，通過雙質(zhì)粒系統(tǒng)的檢測，發(fā)現(xiàn)P4-like整合酶與DR區(qū)

8、能夠介導最小單元的轉移。
　　5.在最小單元的與相應的受體構建的雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)在基因島的邊界處存在大約100bp的輔助因子結合序列。
　　6.利用純化的P4-like整合酶進行體外酶切實驗發(fā)現(xiàn)，P4-like整合酶具有兼性拓撲異構酶的功能，并能夠特異性的結合到DR序列上。
　　研究結論:
　　1.GIsul2基因島在轉移的同時能夠介導ISCR2單元的轉移。在轉移的過程中，除了P4-like整合酶和DR序列