腎素過表達及聯(lián)合用藥對動脈粥樣硬化及斑塊炎癥影響的實驗研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，也是冠心病、心肌梗塞及腦卒中的主要病因。目前研究認為AS是由多種致病因素引起的以內(nèi)皮細胞損傷為基礎(chǔ)、以血管的慢性炎癥為特征的病理過程。
　　 目前研究認為動脈粥樣硬化斑塊分為穩(wěn)定性斑塊和不穩(wěn)定性斑塊兩類。不穩(wěn)定性斑塊的突出特征是具有較大的脂質(zhì)核、較薄的纖維帽和大量的炎性細胞浸潤，膠原和平滑肌細胞數(shù)量少，是引起包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗

2、塞和心源性猝死在內(nèi)的急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的病理基礎(chǔ)。動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性與斑塊的內(nèi)部成分變化密切相關(guān)，斑塊內(nèi)的巨噬細胞、泡沫細胞、T-淋巴細胞等的多種炎癥細胞通過分泌大量細胞因子及蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)并促進平滑肌細胞凋亡，進而增加斑塊易損性。
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)由一系列酶、肽類、激素及其受體所組成，在A

3、S發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS重要的末端活性產(chǎn)物，通過作用于1型受體(AT1)和2型受體(AT2)而發(fā)揮其生物學效應。腎素可特異性地切割血管緊張素原N-端第10與第11位氨基酸之間的肽鍵，催化血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ，后者再轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，從而激活RAS。這是RAS級聯(lián)反應中的限速步驟。腎素是腎素原在激活酶催化作用下生成的一種蛋白酶。腎素作為AngⅡ上游的RAS成員，在心腦血管遺傳學研究中越來越受

4、到人們的重視，其基因多態(tài)性成為高血壓、冠心病和腦卒中的疾病的候選基因。近幾年隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腎素和其前體腎素原，通過與腎素原受體結(jié)合，經(jīng)由兩種途徑發(fā)揮生物學作用，一種是依賴血管緊張素途徑，即催化血管緊張素原轉(zhuǎn)化為AngⅠ，進而在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；另一種是非血管緊張素途徑，即通過不生成血管緊張素(Ang)的方式直接激活細胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生生物學作用。然而目前對于腎素/腎素原和其受體-腎素原受體的研究和認識還不全面深入，在對人腎素

5、基因與疾病關(guān)系的研究中以與原發(fā)性高血壓相關(guān)性研究較多，探討其與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究報道很少。因此本研究首先構(gòu)建了腎素基因過表達的腺相關(guān)病毒載體，于體內(nèi)外實驗中觀察對動脈粥樣硬化PAS系統(tǒng)及相關(guān)炎癥因子、信號通路的影響，初步探討腎素在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為動脈粥樣硬化的治療提供新的理論依據(jù)和技術(shù)策略。
　　 越來越多的證據(jù)表明血脂代謝紊亂和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活在AS病理過程中起了重要作用。氧化型低密

6、度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，OX-LDL)促進了內(nèi)皮細胞和巨噬細胞表面的血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)的表達。植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidizedlow density lipoprotein receptor-1，LOX-1)在內(nèi)皮細胞損傷、單核細胞與內(nèi)皮細胞粘附及泡沫細胞形成過程中起了重要作用，是內(nèi)皮細胞損傷的早期標志物。LOX-1在動脈粥樣硬

7、化中的作用機制尚不甚清楚，有研究報道，Ox-LDL與LOX-1的結(jié)合開始于NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活，同時增加細胞內(nèi)ROS的形成。單核細胞與內(nèi)皮細胞粘附并遷移到內(nèi)皮下組織是AS早期的病理特征，單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1作為一種重要的趨化因子在此病理過程中起重要作用。聯(lián)合使用HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和AT1R拮抗劑(ARB)常用于治療臨床上伴有血脂代謝紊亂的高血

8、壓病人，并可以進一步減輕其AS程度，本文在觀察了腎素過表達與AS關(guān)系后又觀察并初步探討了聯(lián)合用藥對AS炎癥斑塊及相關(guān)因子的影響。
　　 第一部分人腎素基因腺相關(guān)病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:
　　 構(gòu)建人腎素基因腺相關(guān)病毒表達載體，并包裝純化出高滴度病毒，為研究腎素高表達對動脈粥樣硬化影響的后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建pDC316-Ren質(zhì)粒；
　　 以原始質(zhì)粒

9、REN為模版設(shè)計引物擴增Ren片段，經(jīng)SalⅠ和BglⅡ雙酶切連接入載體質(zhì)粒pDC316，轉(zhuǎn)化得到pDC316-Ren質(zhì)粒。酶切電泳和測序鑒定。
　　 2.以pSNAV2.0-tdRFP質(zhì)粒構(gòu)建pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren；以pDC316-Ren質(zhì)粒為模版設(shè)計引物擴增mcmv-ren-polyA片段，經(jīng)BamHI單酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒PSNAV2.0-tdRFP，連接，轉(zhuǎn)化得到pSNAV2.0-tdRFP-

10、mCMV-Ren質(zhì)粒。酶切電泳和測序鑒定。
　　 3.rAAV2-Ren-RFP的制備純化，鑒定及滴度測定。
　　 將2.0-Ren-RFP質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)后，將此混合細胞株命名為BHK/HIF-2。將rAAV2-Ren-RFP的生產(chǎn)細胞株經(jīng)HSV1-rc/△UL2感染(MOI為0.1)后，包裝產(chǎn)生重組rAAV2-Ren-RFP，PCR擴增目的基因加以鑒定。

11、鑒定正確的rAAV2-Ren-RFP用地高辛標記的CMV探針點雜交方法檢測病毒液中rAAV2-Ren-RFP的物理滴度(以病毒基因組數(shù)/mL，vg/ml表示)。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組質(zhì)粒pDC316-Ren經(jīng)SalⅠ和BglⅢ雙酶切預期產(chǎn)生大小分別3.8kb和1.2kb左右兩條帶，電泳結(jié)果與預期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確，送測序正確。
　　 2.重組質(zhì)粒pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren經(jīng)Ba

12、mHI單酶切預期產(chǎn)生大小分別為7.8kb和1.9kb左右兩條帶，而電泳結(jié)果與預期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確，測序鑒定正確。
　　 3.重組rAAV2-Ren-RFP病毒經(jīng)PCR鑒定，能夠特異擴增出1.9kb左右大小的目的基因條帶，證明該重組腺相關(guān)病毒攜帶有目的基因Ren。
　　 4.用地高辛標記的CMV探針點雜交方法檢測病毒液中rAAV2-Ren-RFP的物理滴度(以病毒基因組數(shù)/mL，vg/ml表示)。通過計算Ren的

13、拷貝數(shù)、再乘以與其雜交信號強度一致的病毒液樣品的稀釋倍數(shù)，得出rAAV2-Ren-RFP的物理滴度為8.3×1011 vg/ml。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316-Ren和pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren；
　　 2.成功構(gòu)建重組rAAV2-Ren-RFP病毒載體；
　　 3.包裝純化出高滴度病毒，為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分腎素基因過表達對動脈粥

14、樣硬化影響的體內(nèi)外研究
　　 目的:
　　 于體內(nèi)外觀察腎素過表達對動脈粥樣硬化中RAS系統(tǒng)和相關(guān)炎癥因子的影響，探討腎素在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的作用，為進一步進行動脈粥樣硬化治療的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)策略。
　　 方法:
　　 1.32只雄性新西蘭大白兔先高脂喂養(yǎng)一周，然后行腹主動脈內(nèi)膜損傷術(shù)，并繼續(xù)高脂喂養(yǎng)12周形成AS斑塊，于12周末隨機分為3組即高脂組、rAAV2-RFP空載體組和rAAV2-

15、Ren-RFP腎素基因表達組，于腹主動脈斑塊明顯處分別局部轉(zhuǎn)染5×1010vg/只的rAAV2-RFP或rAAV2-Ren-RFP。16周末處死動物取材，HE和油紅0染色分別觀察AS斑塊程度和血管內(nèi)膜脂質(zhì)情況；免疫組化檢測AS斑塊內(nèi)腎素是否成功表達及各組巨噬細胞、VCAM-1的表達；RT-PCR檢測各組VCAM-1、MCP-1mRNA的表達；Western blot檢測各組間腎素表達水平。
　　 2.原代培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)傳代

16、，依據(jù)細胞形態(tài)及抗Ⅷ因子抗體鑒定后，取生長良好的3-8代用于實驗。預先加入100MOIrAAV2-RFP孵育HUVECs，分別于24、48、72小時熒光顯微鏡下監(jiān)測熒光強度，選取熒光最強時間點進行后續(xù)細胞實驗--RT-PCR及Western blot檢測，分析轉(zhuǎn)染rAAV2-Ren-RFP后的renin及炎癥因子VCAM-1、MCP-1等的表達，分析高表達的renin對AS相關(guān)炎癥因子蛋白和mRNA表達的影響。Western blot檢

17、測高表達的腎素對相關(guān)信號通路蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.HE染色顯示腎素基因表達組血管內(nèi)膜增厚，脂滴積聚；免疫組化顯示腎素成功于轉(zhuǎn)染斑塊處表達，且腎素基因轉(zhuǎn)染組的斑塊內(nèi)巨噬細胞浸潤增多，炎癥因子VCAM-1表達增加，斑塊潛在不穩(wěn)定性增加；RT-PCR檢測AS相關(guān)炎癥因子VCAM-1、MCP-1mRNA表達增加。Western blot顯示腎素基因轉(zhuǎn)染組腎素蛋白表達亦增加。
　　 2.rAAV2-RF

18、P轉(zhuǎn)染HUVECs不同時間發(fā)現(xiàn)，于48小時熒光最強，即選取48小時收獲細胞進行后續(xù)檢測。Western blot檢測顯示腎素基因轉(zhuǎn)染組細胞的腎素蛋白大量表達，炎癥因子蛋白表達量增多；RT-PCR檢測各組細胞的mRNA表達水平，與蛋白表達趨勢一致。Western blot檢測信號通路蛋白表達顯示p-ERK、p-P38MAPK、p-JNK表達增多。
　　 結(jié)論:
　　 體內(nèi)外實驗顯示，轉(zhuǎn)染rAAV2-Ren-RFP組與rAA

19、V2-RFP組相比，前者炎癥因子的基因及蛋白表達均增加，表明腎素表達量增多時，AS相關(guān)炎癥因子表達水平亦增加，斑塊潛在不穩(wěn)定性增加。調(diào)控RAS上游的腎素基因，或許可以為動脈粥樣硬化的治療提供新的技術(shù)策略。
　　 第三部分 HMG-CoA還原酶抑制劑和ARB聯(lián)合應用對動脈粥樣硬化斑塊及相關(guān)炎癥因子的影響
　　 目的:
　　 體內(nèi)研究聯(lián)合應用HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和ARB對AS斑塊炎癥及早期AS的影響，并進

20、一步探討其分子機制。
　　 方法:
　　 將1.5-1.63kg重的雄性新西蘭大白兔36只先行一周的正常飲食，然后被隨機分為4組：高脂組(CH，n=9)即單純飼以高脂飲食(1％膽固醇+5％豬油顆粒)；氯沙坦組(L，n=9)即高脂飲食+氯沙坦(25mg/kg/d)；氟伐他汀組(F，n=9)即高脂飲食+氟伐他汀(10mg/kg/d)；氟伐他汀+氯沙坦組(F+L，n=9)即高脂飲食+氟伐他汀(10mg/kg/d)+氯沙坦(25

21、mg/kg/d)。另取8只1.5-1.63kg重的雄性新西蘭大白兔作為陰性對照組飼以正常飲食，以觀察高脂飲食致AS斑塊的病變程度。16周末收集兔耳緣靜脈血檢測血脂水平變化，剝離完整胸主動脈，HE染色觀察AS斑塊病變程度和內(nèi)膜厚度；油紅O染色檢測AS斑塊中脂質(zhì)含量；免疫組化染色法檢測并分析細胞因子MCP-1在斑塊中含量以及巨噬細胞浸潤程度和血管平滑肌細胞(SMCs)數(shù)量變化；RT-PCR檢測各組MCP-1mRNA水平變化；Western

22、blot檢測各組p38MAPK蛋白含量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組血脂水平變化：16周末兔耳緣靜脈取血，檢測發(fā)現(xiàn)氯沙坦組(L)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平無顯著性差異，氟伐他汀組(F)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平明顯降低(P<0.01)，氟伐他汀+氯沙坦組(F+L)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平亦明顯降低(P<0.01)，提示氯沙坦

23、單獨使用并沒有明顯的降血脂作用。
　　 2.各組內(nèi)膜厚度(I)和內(nèi)膜厚度/中膜厚度(I/M)變化：與單純高脂組(CH)相比，氟伐他汀組(F)和氯沙坦組(L)內(nèi)膜厚度(I)和內(nèi)膜厚度/中膜厚度(I/M)均明顯降低(P<0.01)，而氟伐他汀+氯沙坦組(F+L)的I和I/M進一步降低(分別與F、L組相比，P<0.01)，提示兩藥聯(lián)合使用對AS具有協(xié)同抑制效應。
　　 3.組織學檢測
　　 HE染色發(fā)現(xiàn)，正常飲食組內(nèi)膜

24、結(jié)構(gòu)正常，無斑塊形成；CH組胸主動脈內(nèi)膜明顯增厚，管腔變窄，鏡下可見大量泡沫細胞；F組和L組的內(nèi)膜亦增厚，但與CH組相比，AS程度明顯減輕；F+L組則進一步減輕了AS的程度。油紅O染色，CH組內(nèi)膜脂質(zhì)含量豐富；F組和L組的脂質(zhì)含量明顯減少；F+L組脂質(zhì)含量進一步減少。
　　 4.免疫組化：CH組增厚的內(nèi)膜中可見大量巨噬細胞浸潤，F(xiàn)組和L組均明顯減少了巨噬細胞浸潤(P<0.01)，F(xiàn)+L組巨噬細胞浸潤程度進一步減輕(P<0.01)

25、；各組間SMCs表達無明顯差異。免疫組化顯示，CH組增厚的內(nèi)膜中可見大量MCP-1陽性顆粒表達，與CH組相比，F(xiàn)組和L組的MCP-1陽性顆粒表達明顯減少(P<0.01)，而F+L組MCP-1陽性顆粒表達進一步減少(P<0.05)。
　　 5.RT-PCR：與CH組相比，F(xiàn)組和L組的MCP-1mRNA水平明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)+L組的MCP-1mRNA水平進一步降低(P<0.05)。
　　 6.Western blo

26、t：與CH組相比，F(xiàn)組和L組的p38MAPKs表達水平明顯下降(P<0.05)，F(xiàn)+L組的p38MAPKs表達水平進一步降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.氯沙坦單獨使用并無顯著降低AS血脂的作用；
　　 2.HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和ARB的聯(lián)合應用，明顯減輕了AS斑塊內(nèi)巨噬細胞浸潤和內(nèi)膜的厚度面積，減輕了AS程度并穩(wěn)定了易損斑塊。
　　 3.兩者聯(lián)合應用進一步降低了AS斑塊內(nèi)MCP