GAP161聯(lián)合順鉑對腫瘤增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、1、研究背景和目的：
　　惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命健康，其死亡率僅次心血管疾病[1]。針對腫瘤的治療，臨床主要采取手術(shù)切除、放射治療與化療的方式。其中，化療在癌癥的治療中占重要地位。理想的化療是對腫瘤細(xì)胞有選擇性的殺傷，而對正常細(xì)胞無明顯毒性，由于癌細(xì)胞與人正常組織細(xì)胞間缺乏根本性的代謝差異，使大部分化療藥物的選擇性較差，對腫瘤細(xì)胞的特異性不高，毒副作用強(qiáng)烈，治療效果不盡如人意。非特異性化療藥物順鉑就是其中之一。其屬于金屬鉑類制劑

2、，適用于胃癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、前列腺癌等[2]，是目前臨床運(yùn)用最廣，作用最強(qiáng)的抗腫瘤藥物之一[3]，但由于毒性作用較大，劑量的增加往往導(dǎo)致不良反應(yīng)的增多，長期反復(fù)使用易產(chǎn)生多藥耐藥等，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此，如何解決順鉑毒性大，減輕其嚴(yán)重的耳腎毒性，提高藥物的療效，已成為腫瘤科亟待解決的實(shí)際問題。針對以上問題，研究者們開展了多方面的研究。如多方式的聯(lián)合用藥，靶向藥物的研制等。
　　G3BP屬于RNA結(jié)合蛋白家族成

3、員，是一種RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域段特異性結(jié)合蛋白，其參與Ras的下游傳導(dǎo)通路。G3BP N-端都具有NTF2樣結(jié)構(gòu)域，Kennedy等[4]發(fā)現(xiàn)RasGAP的SH3結(jié)構(gòu)域與G3BP的結(jié)合是依賴于與NTF2樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而參與RasGAP的信號傳導(dǎo)。Ras是一個(gè)原癌基因，具有GTPase活性，通過受體酪氨酸激酶激活信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。Ras信號途徑參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞骨架的形成和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等。RasGAP可促進(jìn)Ra

4、s GTPase的活性，將活性RasGTP水解為無活性RasGDP，從而達(dá)到負(fù)性調(diào)節(jié)Ras的活性?；谝陨涎芯亢驼J(rèn)識，人們推斷G3BP與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，以G3BP為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研究具有廣闊的前景。肽GAP161就是以G3BP為靶標(biāo)合理設(shè)計(jì)出來的。
　　本研究目的在于通過多種實(shí)驗(yàn)方法不同角度初步探討以G3BP為靶點(diǎn)所設(shè)計(jì)的全新多肽藥物GAP161聯(lián)合順鉑對腫瘤增殖與凋亡的影響，為進(jìn)一步挖掘二者聯(lián)合用藥在抗腫瘤

5、方面存在的潛能提供理論依據(jù)。
　　2、研究方法：
　　體外培養(yǎng)人肝癌HepG2、人結(jié)腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782細(xì)胞株。采用MTT法檢測不同濃度的GAP161單用及聯(lián)合順鉑對細(xì)胞增殖的影響。
　　采用Hoechst33342單染技術(shù)觀察多肽GAP161單用及聯(lián)合順鉑對乳腺癌MA-782細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)雙染法檢測GAP161單用及聯(lián)合順鉑對乳腺癌MA-78

6、2細(xì)胞凋亡的影響。
　　采取最大劑量單次給藥來評價(jià)GAP161的安全性。
　　建立小鼠乳腺癌腫瘤模型，通過繪制瘤體生長曲線，稱瘤重，觀察藥物對小鼠移植瘤生長的影響，從而計(jì)算抑瘤率。
　　運(yùn)用HE染色的手段，觀察各處理組藥物對小鼠瘤體及肝、腎、脾相關(guān)內(nèi)臟病理學(xué)的改變。采用免疫組化的方法，檢測藥物對小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　3、研究結(jié)果：
　　1、GAP161和順鉑對多種腫瘤細(xì)胞均有劑量依賴性

7、的抗增殖作用。聯(lián)合給藥組表現(xiàn)為協(xié)同作用，較順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），在相同的抑癌效果下可降低順鉑的使用量;且在相同濃度梯度下，聯(lián)合用藥組對Panc-1的抑制效果較差，對MA-782效果最好。
　　2、倒置顯微鏡觀察，聯(lián)合用藥組細(xì)胞與順鉑組相比，MA-782細(xì)胞形態(tài)改變愈加明顯。對MA-782細(xì)胞行Hoechst33342染色，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡形態(tài)特征與順鉑組相比更為顯著，染色質(zhì)凝集現(xiàn)象增多;流式細(xì)胞術(shù)

8、檢測顯示，與順鉑組相比，聯(lián)合給藥組細(xì)胞早期凋亡率顯著升高，其凋亡率由(30.03±0.93)％增至(61.67±0.81)％，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，多肽GAP161對小鼠無明顯急性毒性作用。
　　4、GAP161組，順鉑組，GAP161聯(lián)合順鉑組抑瘤率分別為:5.37％，38.63％，53.52％。瘤體HE染色結(jié)果顯示GAP161組，順鉑組同聯(lián)合用藥組的腫瘤細(xì)胞均發(fā)生部分壞死、核固

9、縮且聯(lián)合用藥組愈加明顯。小鼠主要內(nèi)臟器官HE染色結(jié)果表明，GAP161在增強(qiáng)順鉑化療療效的同時(shí)并未增加其毒副作用。免疫組化結(jié)果證實(shí)，聯(lián)合給藥組與GAP161組，順鉑組及陰性對照組比較，其小鼠腫瘤組織內(nèi)Survivin蛋白表達(dá)明顯減弱、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、結(jié)論：
　　GAP161聯(lián)合順鉑在體外對多種腫瘤細(xì)胞具抗增殖效應(yīng)，且兩藥聯(lián)合具協(xié)同作用。GAP161聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)乳腺