IFN-γ誘導支氣管上皮細胞高表達Galectin-9介導造血干細胞移植后肺免疫保護及機制的研究.pdf

1、第一部分肺在急性移植物抗宿主病中的相對免疫逃逸效應
　　目的:目前肺在急性移植物抗宿主病中是否受到免疫攻擊而被赦免尚存在爭議。建立一個成熟可靠的小鼠移植后肺免疫保護模型,為后期異基因移植后肺免疫保護的深入研究提供理想的實驗模型和依據(jù)。
　　方法:建立小鼠aGVHD模型,分別是C57BL/6J→C57BL/6J,同基因組;C57BL/6J→B6D2F1同種異基因半相合組;C57BL/6J→BALB/C,脾與骨髓細胞為2:1;C

2、57BL/6J→BALB/C,脾與骨髓細胞為4:1;移植成功后觀察aGVHD臨床評分和生存期,檢測外周血白細胞計數(shù)和嵌合體,測肺、肝、腸、皮膚組織病理,ELISA檢測移植后肺組織中IFN-γ水平。
　　結(jié)果:同種異基因組小鼠42天生存率為20％,在移植后28天小鼠出現(xiàn)GVHD典型臨床表現(xiàn)和病理損傷,但肺組織損傷與經(jīng)典靶器官肝、小腸、皮膚相比明顯減輕,在同基因組中移植小鼠42天全部生存,無GVHD臨床表現(xiàn);而MHC完全不相合組出現(xiàn)嚴

3、重的GVHD表現(xiàn),移植后12天半數(shù)小鼠死亡,移植物脾和骨髓細胞為4:1組還出現(xiàn)嚴重的間質(zhì)性肺炎改變;移植瀕死狀態(tài)的小鼠其外周血白細胞計數(shù)為(1.69±0.12)×109/L,在移植后第30天和60天可檢測到供者型Y染色體;同種異基因組小鼠在移植后第1和2周肺組織中IFN-γ明顯升高,其峰值為(188.6±12.7)pg/ml,而完全不相合組(2:1和4:1)在移植后第1和2周IFN-γ有輕度升高,與同種異基因組相比具有顯著性差異(P<0

4、.05)。
　　結(jié)論:造血干細胞移植后肺存在相對免疫赦免,它與輸注的淋巴細胞數(shù)、肺內(nèi)IFN-γ水平相關(guān)。
　　第二部分Galetin-9在急性移植物抗宿主病中的表達和作用
　　目的:體內(nèi)探討IFN-γ依賴性Gal-9在急性移植物抗宿主病中的表達和體內(nèi)機制。
　　方法:建立小鼠aGVHD移植模型:C57BL/6J→C57BL/6J,同基因組;C57BL/6J→B6D2F1,野生型組;IFN-γ-/-→B6D2F1,

5、供者IFN-γ-/-組;C57BL/6J→IFN-γR-/-,受者IFN-γR-/-組;觀察移植后小鼠的生存期和臨床評分,HE染色觀察肺、肝、腸、皮膚組織病理,支氣管肺泡灌洗術(shù)檢測灌洗液中總細胞數(shù)、總蛋白量及肺濕/干比重;+7天Tunel檢測肺中細胞凋亡,+28天流式和ELISA檢測T細胞亞群和細胞因子水平;免疫組化、免疫熒光、ELISA和Westernblot檢測肺、小腸、皮膚、肝中Gal-9的表達;為探討Gal-9特異性的肺保護,對

6、供者IFN-γ-/-組和受者IFN-γR-/-組經(jīng)鼻灌注吸入Gal-9蛋白,觀察小鼠生存期和肺病理,ELIAS檢測IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-17變化。
　　結(jié)果:同基因移植組小鼠42天全部存活,無GVHD臨床表現(xiàn)和病理改變;野生型組小鼠可有aGVHD表現(xiàn),24天生存率為大于50%,在移植后28天肺組織病理改變比經(jīng)典靶器官肝、小腸、皮膚明顯輕微;供者IFN-γ-/-組和受者IFN-γR-/-組小鼠均有致死性GVHD表現(xiàn)

7、,14天內(nèi)全部死亡,肺組織出現(xiàn)嚴重病理改變,BALF中總細胞數(shù)和總蛋白量及肺濕/干比重在移植后1周明顯增高;Tunel提示異基因組小鼠肺中存在大量凋亡細胞,供者IFN-γ-/-組和受者IFN-γR-/-組凋亡細胞很少見,流式和ELISA檢測顯示這兩組小鼠在移植后第7天肺組織中CD4+和CD8+細胞明顯升高;在供者IFN-γ-/-小鼠中IL-4明顯升高,受者IFN-γR-/-組中IFN-γ和IL-17升高;免疫組化、免疫熒光、ELISA和

8、Westernblot檢測均發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠肺中Gal-9高表達;經(jīng)鼻灌注吸入Gal-9蛋白可顯著改善供者IFN-γ-/-和受者IFN-γR-/-移植小鼠的生存期和肺組織病理,在供者IFN-γ-/-小鼠體內(nèi)與IL-4和IL-17下降相關(guān),而在受者IFN-γR-/-小鼠體內(nèi)與IFN-γ和IL-17水平下降相關(guān)。
　　結(jié)論:IFN-γ依賴性Gal-9可促進活化T細胞亞群耗竭或/和其分泌的細胞因子降低,在造血干細胞移植后肺損傷的免疫保護

9、中起重要作用。
　　第三部分IFN-γ促進支氣管上皮細胞高表達Galectin-9經(jīng)Casapse-3途徑誘導T細胞凋亡
　　目的:體外探討IFN-γ對支氣管上皮細胞中Galectin-9的誘導及高表達的Galectin-9對T細胞凋亡的作用和機制。
　　方法:用纖支鏡灌洗刷從正常人的支氣管中段分離出支氣管上皮細胞(HBE),用CK-18、CK-19和Vimentin鑒定支氣管上皮細胞;用濃度為0,0.08,0.4,2

10、,10,50ng/ml的IFN-γ和濃度為10ng/mlIFN-γ刺激支氣管上皮細胞0,3,6,12,24,48h,Real-timePCR和Westernblot檢測Gal-9表達;CD3+免疫磁珠分選人的T細胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,加入ConA和IFN-γ或IL-4或IL-17培養(yǎng)12小時,流式細胞儀檢測T細胞亞群、CD69和Tim-3的表達率;將IFN-γ預處理的HBE與T細胞共培養(yǎng)24h,流式檢測T細胞凋

11、亡,采用Tim-3-FC阻斷和Transwell培養(yǎng)進行阻斷;分光光度儀檢測T細胞凋亡中Caspase家族的活化,用Caspase-3(z-DEVD-fmk)或Caspase-4抑制劑(Ac-LEVD-cho)對比T細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:培養(yǎng)出的支氣管上皮細胞中CK18和CK19大量表達,而vimentin無表達;IFN-γ誘導HBE高表達Gal-9,呈時間和濃度依賴性,其最佳誘導濃度和時間為10ng/ml和24h;免疫磁珠

12、從外周單個核細胞分出T細胞(CD3+)比值為(86.2±5.21)%,ConA刺激T細胞后其CD69表達率為(72.11±3.14)%,加入IFN-γ、IL-4和IL-23其Th1、Th2和Th17細胞表達率分別為(71.3±2.09)%,(62.3±3.51)%,(42.3±6.12)%;將HBE與T細胞進行共培養(yǎng),未采用IFN-γ預處理組的T細胞凋亡率為(1.9±0.12)%,用IFN-γ預處理組其T細胞凋亡率為(18.5±1.46

13、)%,并可被Tim-3-FC部分阻斷(8.1±0.33)%;在transwell共培養(yǎng)中,T細胞凋亡率為(12.6±2.31)%;分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)在IFN-γ預處理的HBE與T細胞共培養(yǎng)中,Caspase-3和Caspase-4活化水平上調(diào),加入Caspase-3抑制劑后T細胞凋亡明顯減少,為(13.4±2.13)%,但Caspase-4抑制劑后T細胞凋亡未見明顯影響。
　　結(jié)論:IFN-γ誘導HBE高表達Gal-9,后者與活化