液相芯片技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是由多種病原體（病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、朊病毒等）所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見和多發(fā)性疾病。嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)感染進(jìn)展迅速，死亡率高，或留下嚴(yán)重的后遺癥。為了降低該類疾病的死亡率和提高治愈率，這時(shí)對患者腦脊液中的病原體進(jìn)行早期、快速的檢測鑒定就顯得十分重要了。早期、準(zhǔn)確的診斷可以幫助臨床醫(yī)生及時(shí)給予病人有效的藥物治療。
　　目的：目前，病原體的診斷方法主要依賴于腦脊液染色鏡檢，病原體培養(yǎng)，PCR技術(shù)等。但是，傳統(tǒng)的

2、檢測方法受多種客觀因素的影響,達(dá)不到早期、快速、準(zhǔn)確診斷的目的。液相芯片技術(shù)具有高通量、準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異、可定性定量檢測等顯著優(yōu)點(diǎn)。在本研究中，我們基于液相芯片技術(shù)建立一種能夠早期、快速、高通量檢測多種病原體的診斷方法。方法：本實(shí)驗(yàn)以腦膜炎和腦炎常見的5種病原體（結(jié)核分枝桿菌、新生隱球菌、肺炎鏈球菌、單純皰疹病毒1,2型）為研究對象。我們通過選擇5種病原體的特異性基因，從GenBank獲得保守基因序列，進(jìn)行序列比對，保證其特異性。

3、應(yīng)用oligo6.65設(shè)計(jì)特異性引物及寡核苷酸探針，通過生物信息學(xué)分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出針對五種病原體的5對特異性引物及相應(yīng)的探針。首先用5’-H2NC12標(biāo)記的寡核苷酸探針包被編碼微球作為反應(yīng)載體，然后將各種探針熒光微球混合，制作懸浮芯片。該技術(shù)通過探針與單重或多重PCR擴(kuò)增片段的雜交反應(yīng)，來驗(yàn)證檢測的特異性和敏感性。最后，通過對臨床腦脊液標(biāo)本的檢測，評估液相芯片技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測的可行性。結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)中，我們用設(shè)計(jì)的引物分別單重?cái)U(kuò)增

4、五種病原體核酸，PCR擴(kuò)增結(jié)果提示五對引物的設(shè)計(jì)是合適的，均可以實(shí)現(xiàn)對目的基因片段的有效擴(kuò)增。為了保證多重?cái)U(kuò)增的一致性和穩(wěn)定性，確定最佳反應(yīng)條件，需要對多重PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇55℃為適宜的退火溫度，該溫度能夠兼容五對引物的同時(shí)擴(kuò)增。液相芯片技術(shù)檢測的雜交條件優(yōu)化包括雜交溫度和雜交時(shí)間的確定，優(yōu)化后的雜交溫度為55℃，雜交時(shí)間為20min。本實(shí)驗(yàn)所建立的五重檢測體系，可同時(shí)對結(jié)核分枝桿菌、新生隱球菌、肺炎鏈球菌、單純皰疹病

5、毒1,2型進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果與PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了基于液相芯片技術(shù)的五重檢測體系是可行的。通過對結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌和單純皰疹1型病毒的敏感度檢測，敏感度可達(dá)到fg級。其中結(jié)核分枝桿菌的檢測敏感度為224fg/μl，肺炎鏈球菌的敏感度為55fg/μl，單純皰疹1型病毒為35fg/μl。我們還利用液相芯片技術(shù)檢測了41例確診為結(jié)核性腦膜炎患者的CSF標(biāo)本，檢出39例陽性，與檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”相比較，符合率為95.1％；結(jié)核