亞胺培南耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、產(chǎn)氣腸桿菌屬于腸桿菌科之腸桿菌屬，是院內(nèi)獲得性感染的重要病原菌之一，可引起肺炎、心內(nèi)膜炎、皮膚軟組織感染、腹腔感染、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、尿路感染和菌血癥等。近年來(lái)產(chǎn)氣腸桿菌引起的醫(yī)院感染逐年增加，由于不少感染菌株同時(shí)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)，因而對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物存在耐藥性，僅對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物仍維持較高的敏感性。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物對(duì)極大多數(shù)由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶都有較高的穩(wěn)定性，與青

2、霉素結(jié)合蛋白(PBPs)親和力強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的延長(zhǎng)和溶解，能有效滲透細(xì)菌外膜進(jìn)入周質(zhì)間隙，并且存在抗菌藥物后效應(yīng)，是目前所使用的抗菌藥物中抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)，具有快速殺菌作用的一類(lèi)抗菌藥物。隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物臨床應(yīng)用的增加，亞胺培南耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌陸續(xù)被分離，給臨床治療造成困難，引起廣泛重視。 腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的機(jī)制主要有三種： 一、碳青霉烯酶的產(chǎn)生； 二、藥物作用靶位的改變；

3、 三、外膜蛋白(outer member protein)的缺失或數(shù)量的減少伴有質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)高水平β-內(nèi)酰胺酶的持續(xù)產(chǎn)生。 碳青霉烯酶分為A類(lèi)、B類(lèi)和D類(lèi)，目前僅A類(lèi)碳青霉烯酶KPC-2和B類(lèi)碳青霉烯酶IMP-1-like，IMP-1，VIM-2在產(chǎn)氣腸桿菌中有報(bào)道；碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物能與革蘭陰性菌的PBP1和PBP2結(jié)合，如PBP發(fā)生改變抗菌藥物不能結(jié)合或親和力下降，則產(chǎn)生耐藥，目前全世界僅發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)氣腸桿菌由于PBP

4、2a的改變?cè)斐蓙啺放嗄夏退帲粚?duì)革蘭陰性菌而言，外膜通透性對(duì)藥物進(jìn)出菌體至關(guān)重要。膜上有親水性的藥物通道蛋白稱(chēng)外膜蛋白，主要有兩種，分子量較大的為OmpF，分子量較小的為OmpC，外膜蛋白的缺失或數(shù)量的減少均可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥主要由于Omp36的減少或缺失伴有ESBLs和或AmpC的產(chǎn)生引起。Omp36屬于OmpC類(lèi)蛋白家族，為跨膜通道蛋白，暴露于細(xì)胞表面，占據(jù)著膜孔。已有報(bào)道，Omp36的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)

5、與OmpX的調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)密切相關(guān)，從而使決定孔蛋白通道直徑的保守環(huán)Loop 3的電勢(shì)平衡發(fā)生改變，進(jìn)而造成亞胺培南不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。為明確我國(guó)亞胺培南耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌的耐藥機(jī)制，本研究分析了臨床分離到的產(chǎn)氣腸桿菌的克隆相關(guān)性、耐藥性、耐藥基因、耐藥傳播機(jī)制，為亞胺培南耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌感染的防治提供基礎(chǔ)。深入了解產(chǎn)氣腸桿菌的耐藥機(jī)制和耐藥性的傳遞特性，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物和防止耐藥株的流行有著重要的意義。 1.亞胺培南耐藥的產(chǎn)氣

6、腸桿菌耐藥性研究收集2005年1月～3月我院一位肝移植術(shù)后患者分離到的4株產(chǎn)氣腸桿菌，C1、C3分離自腹水，C2、C4分離自血液，其中C3、C4是在患者使用亞胺培南和美羅培南治療40天后分離到。脈沖凝膠電泳(PFGE)結(jié)果表明，4株試驗(yàn)菌株酶切條帶完全一致，均來(lái)自同一克隆株。4株產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星及青霉素復(fù)合制劑哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸均耐藥；對(duì)多粘菌素

7、B、多粘菌素E和替加環(huán)素均敏感；C1、C2對(duì)亞胺培南、美羅培南敏感，而C3、C4對(duì)亞胺培南耐藥、美羅培南中介。接合菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶敏感：對(duì)除頭孢他啶外的三代頭孢菌素和含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、阿米卡星、慶大霉素均耐藥，對(duì)替卡西林/克拉維酸的耐藥性降低。PCR證實(shí)4株產(chǎn)氣腸桿菌TEM-1、CTX-M-3、CTX-M-14、SHV-12和DHA-1基因陽(yáng)性，未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因。TEM-1、CT

8、X-M-3和DHA-1 β-內(nèi)酰胺酶可通過(guò)肉湯接合進(jìn)行轉(zhuǎn)移。Western blot顯示C1、C2表達(dá)OmpE36蛋白，而C3、C4不表達(dá)OmpE36蛋白。PCR擴(kuò)增C3、C4的ompE36基因發(fā)現(xiàn)，在結(jié)構(gòu)基因的97 bp后，IS903-like插入其中，引起ompE36基因的移碼框改變，從而使OmpE36蛋白缺失。通過(guò)基因敲除菌株C1中的ompE36基因可導(dǎo)致亞胺培南、美羅培南的MIC值升高32倍，說(shuō)明OmpE36在亞胺培南耐藥中起著

9、重要的作用。 2.ompE36基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)根據(jù)已發(fā)表的產(chǎn)氣腸桿菌omp36基因序列(GenBank登錄號(hào)AF335467)設(shè)計(jì)引物，對(duì)C1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為1110 bp片段，經(jīng)測(cè)序及BlastN比對(duì)發(fā)現(xiàn)與omp36基因高度同源(核苷酸同源性為95％，氨基酸同源性為89％)新的孔蛋白編碼基因ompE36(GenBank登錄號(hào)EF191076)。將其克隆到原核表達(dá)載體pQE30，與組氨酸(His)標(biāo)簽融合

10、表達(dá)。經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后△OmpE36融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到22.3％。經(jīng)Western blot檢測(cè)也表明，表達(dá)的融合蛋白能與His單抗特異地反應(yīng)。 3.△OmpE36蛋白的純化及兔抗OmpE36多克隆抗體的制備在大腸桿菌中表達(dá)的△OmpE36蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)過(guò)尿素變性，用鎳瓊脂凝膠柱將其純化，通過(guò)Millipore中分子量蛋白超濾管濃縮OmpE36蛋白，得到

11、了純度為93％、濃度為3.3 mg/mL的重組蛋白。并以該濃縮液與弗氏完全佐劑混合乳化后免疫家兔，制備了兔抗OmpE36多克隆抗體，經(jīng)瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定其效價(jià)為1∶32。提純的OmpE36蛋白及制備的多抗為下一步用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)抗體的效價(jià)提供基礎(chǔ)。 4.間接ELISA法檢測(cè)兔抗OmpE36多克隆抗體效價(jià)用表達(dá)的純化的重組OmpE36蛋白抗原包被ELISA板，利用制備的兔抗OmpE36多克隆抗體與該抗原結(jié)合，并對(duì)最

12、適包被濃度、血清稀釋度、最適封閉液、最佳顯色時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn)。獲得的OmpE36抗體的效價(jià)為1∶400。 以上研究表明： 1.我院臨床分離的產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)亞胺培南耐藥是由于產(chǎn)多種β-內(nèi)酰胺酶(TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-14和DHA-1)并伴有OmpE36孔蛋白的缺失所致。 2.脈沖凝膠電泳分析，4株產(chǎn)氣腸桿菌來(lái)自同一克隆株，提示在使用碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物治療感染的同時(shí)，也增加了細(xì)菌對(duì)其耐藥的