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文檔簡介
1、目的:研究DNA低甲基化對穿孔素基因mRNA和蛋白表達的影響。 方法:(1)密度梯度離心分離正常成人的外周血淋巴細胞,磁珠分離CD4<'+>和CD8<'+>細胞后進行細胞培養(yǎng),DNA甲基化抑制劑5-雜氮胞苷(5-azaC)處理。(2)分別提取DNA、RNA和蛋白質。(3)亞硫酸氫鈉處理DNA,巢式PCR進行擴增、轉化入大腸桿菌,挑取克隆測序。(4)實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測穿孔素mRNA的表達,Western
2、-blot檢測穿孔素蛋白量的變化。 結果:(1)5-azaC處理后的CD4<'+>細胞和CD8<'+>細胞穿孔素mRNA和蛋白表達顯著高于未處理的CD4<'+>和CD8<'+>細胞組(P<0.05)。(2)測序結果表明5-azaC處理后的CD4<'+>細胞和CD8<'+>細胞DNA穿孔素啟動子區(qū)域的甲基化水平降低,與未處理的CD4<'+>和CD8<'+>細胞組比較(P<0.05)有顯著性差異。 結論:5-azaC處理后C
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