四川白鵝和朗德鵝肝細胞間差異表達基因的篩選及鑒定.pdf

1、抑制消減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractiveHybridizition，SSH)是以抑制PCR為基礎(chǔ)的一種高效尋找差異表達基因的新方法。本研究應用SSH方法篩選四川白鵝和朗德鵝肝細胞間的差異表達基因，并綜合運用生物信息學方法對EST序列進行篩選、鑒定，由此獲得品種間差異相關(guān)EST信息。取得了以下主要實驗結(jié)論： (1)利用改進“Seglen兩步膠原酶灌注”法成功分離四川白鵝和朗德鵝肝細胞。經(jīng)MTT比色法檢測，在第

2、1～2天細胞活性增加緩慢，在2～3天出現(xiàn)了一定的下降趨勢，但在第3～5天細胞活性迅速增加，之后細胞活性再次降低，與理論“S”型生長曲線基本符合。 (2)首次應用抑制性消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了四川白鵝與朗德鵝肝細胞間正反向差異表達cDNA文庫，共挑選出了3840個單克隆菌落，插入片段主要分布在250～750bp之間，呈隨機分布，表明文庫克隆的插入片斷大小與預期的結(jié)果相符。SSH-1、SSH-2文庫的有效陽性率分別達到了93％和91％

3、。 (3)應用斑點雜交技術(shù)從正反向cDNA消減文庫中篩選差異表達的克隆，部分克隆經(jīng)檢測后，獲得了65個在細胞中表達量明顯上調(diào)的克隆，測序后得到個54個質(zhì)量滿意的差異EST。 (4)通過BLASTn比對，在54個EST中共獲得了50個已知基因、2個已知的EST和2個全新的EST。在這54個EST序列中，已知基因占92.6％；已知EST占3.7％；全新占EST為3.7％。所得到的已知基因按照基因功能初步分為信號轉(zhuǎn)導與細胞間通

4、信、細胞結(jié)構(gòu)與運動、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞凋亡、細胞與機體防御、翻譯與表達調(diào)控、代謝及其它共8類，其中參與信號轉(zhuǎn)導/細胞間通信和細胞結(jié)構(gòu)的兩類基因所占比例分別為16％和28％，翻譯與表達調(diào)控的基因占14％，其它功能方面基因所占比例較低。 (5)肌動蛋白(actinrprotein，ACTB)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、長鏈脂肪酸延伸酶基因(ELOVL)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threoninekinase)、蛋白翻譯