JAKs-STATs信號通路關(guān)鍵基因在家兔腸炎發(fā)生中的作用研究.pdf

1、家兔腸炎是養(yǎng)兔業(yè)中危害最嚴(yán)重的消化道代謝疾病。根據(jù)腸炎病因的來源，可以將腸炎分為已知病原體的腸炎（腸炎）和未知病因的腸炎（非特異性腸炎）兩大類。目前普遍認為腸炎的發(fā)生主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素有關(guān)，然而相關(guān)發(fā)病機制尚不清楚，有待深入深究。JAKs-STATs信號通路廣泛參與機體細胞的增殖、分化、存活、凋亡，介導(dǎo)機體免疫調(diào)控和腫瘤發(fā)生等生命活動過程，且有報道指出IL-23R-JAKs-STAT3信號通路與人類的炎癥性腸病(IBD)相關(guān)。

2、因此，本試驗期望從JAKs和STATs兩大基因家族中，找到與家兔腸炎相關(guān)基因的cSNP，并探討JAKs-STAT3信號通路在家兔腸炎發(fā)病過程中的分子作用機制。本試驗采用case-control實驗設(shè)計，以480只新西蘭兔(case253只，control227只)為試驗對象，篩查JAK1，JAK2，TYK2，STAT1，STAT3和STAT5a基因的cSNP，并進行JAK1，STAT3基因與腸炎易感性的關(guān)聯(lián)性分析;在低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸

3、炎群體中（60只），檢測JAK1，STAT3基因在回腸、結(jié)腸組織中的mRNA表達水平;通過培養(yǎng)家兔原代小腸上皮細胞(IEC)并用LPS構(gòu)建家兔IEC炎癥細胞模型;在炎癥細胞模型中篩選有效下調(diào)JAKs(JAK1，JAK2和TYK2)基因表達水平的高效siRNA分子和Westernblot檢測STAT3蛋白表達水平，并利用RAN-Seq技術(shù)對轉(zhuǎn)染si-JAK1的IEC炎癥細胞模型組及對照組進行轉(zhuǎn)錄本的測序驗證，分析JAKs-STAT3在家兔

4、腸炎發(fā)病中的不同作用。獲得以下主要結(jié)果:
　　1.利用PCR產(chǎn)物純化后直接測序法，篩查新西蘭兔JAKs和STATs兩個家族六個基因的編碼區(qū)cSNP，共發(fā)現(xiàn)22個cSNP，分別是JAK13個，JAK21個，TYK25個，STAT15個，STAT34個和STAT5a4個。其中，JAK1 c.1421 C＞T和TYK2 c.1477 C＞T是非同義突變，分別導(dǎo)致氨基酸p.Thr474 Met(T＞M)和p.Leu404 Phe(L＞F)

5、的改變，其余的cSNP均為同義突變。通過非同義突變導(dǎo)致氨基酸損害程度分析和同義突變密碼子偏好性分析，選擇JAK1 c.1421，c.3036和STAT3 c.399，c.831四個cSNP進行家兔腸炎case-control關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1等位基因C(c.1421)和A(c.3036)分別是風(fēng)險等位基因和保護等位基因;STAT3等位基因C(c.831)和G(c.399)分別是風(fēng)險等位基因和保護等位基因。運用多因子降維法(MD

6、R)分析JAK1(c.1421 C＞T、c.3036 A＞G)和STAT3(c.399 G＞A、c.831 T＞C)基因的遺傳交互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個cSNP組成8個遺傳交互作用模型，其中7個模型對家兔腸炎的易感性存在交互作用，模型(命名:c1421，c3036，c831)顯著地與家兔腸炎易感性相關(guān)(OR:2.7262;95％ CI:4.7408-5.1986;P＜0.0001)。
　　2.在低纖維日糧誘導(dǎo)試驗的家兔群體中，熒光定量

7、PCR(qPCR)試驗分析發(fā)現(xiàn)JAK1(c.1421C＞T)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴(yán)重組表達量最高，分別為0.2398±0.0145和0.1835±0.0175。JAK1基因在嚴(yán)重組回腸中的表達量極顯著高于健康組(P=0.0056)，顯著高于輕微炎癥組(P=0.039)。在回腸中CC基因型的表達量與CT和TT基因型表達量的差異分別達到顯著水平(P=0.031)和極顯著水平(P=0.0082);在結(jié)腸中只有CC基因型與TT基因型的mRNA表

8、達量呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.026)。STAT3(c.399 G＞A)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴(yán)重組表達量最高，分別為0.3598±0.0249和0.2881±0.0671。STAT3基因在嚴(yán)重組回腸中的表達量極顯著高于健康組(P=0.0089)，顯著高于輕微炎癥組(P=0.013)，健康組和輕微組相互之間差異也達到顯著水平(P=0.045)。在回腸中AA基因型的表達量與GG基因型表達量的差異達到極顯著水平(P=0.0012);在結(jié)腸中AA基

9、因型與AG、GG基因型的mRNA表達量均呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.036，P=0.029)，而AG和GG基因型之間的mRNA表達水平差異不顯著(P=0.219)。
　　3.采用膠原酶Ⅰ（0.2mg/ml）成功分離培養(yǎng)家兔原代IEC，運用相差消化法及相差貼壁法純化IEC，經(jīng)CK-18單克隆抗體鑒定其純度達95％以上。純化后的IEC培養(yǎng)體系中添加終濃度為1000ng/ml的LPS并作用24h，再利用ABC-ELISA法檢測到LPS模型組中

10、IL-1β、TNF-α兩個經(jīng)典的急性炎癥早期細胞因子含量均顯著高于同時段對照組(P＜0.01)，結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)兔IEC炎癥細胞模型構(gòu)建成功。
　　4.利用陽性對照si-Pcontrol-GAPDH和熒光Cy3標(biāo)記的陰性對照si-Ncontrol05815確定了最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系，獲得能夠有效下調(diào)JAK1，JAK2和TYK2基因表達的siRNA分子(si-JAK1-001，si-JAK2-001和si-TYK2-003)。通過調(diào)

11、整siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度，使其沉默靶基因的效率基本一致(70％)，通過qPCR檢測STAT3基因在已轉(zhuǎn)染高效siRNA的炎癥細胞模型中mRNA表達水平，以及利用Westeren blot分析p-STAT3(Tyr705)和STAT3總蛋白的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、TYK2分別下調(diào)STAT3基因的mRNA表達水平為76.34％、23.89％和42.14％，分別下調(diào)p-STAT3表達水平0.71％，0.24％和0.35％，而總蛋

12、白水平卻沒有明顯變化，表明JAK1是導(dǎo)致STAT3(Tyr705)位磷酸化的主因。
　　5.通過RNA-Seq技術(shù)對轉(zhuǎn)染si-JAK1-001的IEC炎癥細胞模型和對照組的測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用RNA fragmentation策略構(gòu)建測序文庫可以獲得良好的測序隨機性和較高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，與參考基因比對率約為40.05％，并且大約65％基因的Coverage達到90-100％。RNA-Seq基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)兩組重復(fù)試驗有491個上

13、調(diào)基因，780個下調(diào)基因，涉及到壓力應(yīng)答，類固醇激素刺激應(yīng)答以及免疫系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程。RNA-Seq進一步證實si-JAK1-001可以有效沉默JAK1基因。Pathway顯著性富集分析揭示JAKs-STATs信號通路中相關(guān)基因的功能與家兔IEC炎癥細胞模型的免疫應(yīng)答相關(guān)，且JAK1選擇性顯著下調(diào)STAT1、STAT3、STAT5b基因的表達水平。
　　本研究著重揭示JAK1和STAT3基因與家兔腸炎易感性的關(guān)系;闡述JAK1