系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)研究.pdf

1、1.研究目的:
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種免疫功能紊亂的自身免疫性疾病，以多系統(tǒng)或器官病變和血清中出現(xiàn)多種自身抗體為特征，目前發(fā)病機(jī)制仍不明確。其中血液學(xué)損害為SLE的重要臨床表現(xiàn)，其機(jī)制目前也并不十分清楚。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓微環(huán)境中具有多種分化傾向、高度增殖及自我更新能力的非造血性干細(xì)胞。能在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。BMSCs是造血微環(huán)境中的重要成

2、分，不僅起支持作用，而且分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖分化。針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究可能會(huì)揭示SLE的發(fā)病機(jī)理，解釋血液學(xué)損害原因。
　　細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是受到細(xì)胞內(nèi)基因及細(xì)胞外一些因子調(diào)控的生物學(xué)過程。SLE患者BMSCs長(zhǎng)期處于紊亂的骨髓微環(huán)境，其自身結(jié)構(gòu)與功能也有一定缺陷。對(duì)于SLE患者BMSCs凋亡的研究有利于疾病機(jī)制的闡明，以及新療法的探索。
　　2.研究方法:

3、　　本試驗(yàn)共分為三組:①SLE患者BMSCs組(10人);②其它結(jié)締組織病患者BMSCs組（5人）;③正常人（對(duì)照組）BMSCs組（5人）。前二組患者均合并血液學(xué)損害，取骨髓標(biāo)本前均未使用激素和免疫抑制劑治療。所有SLE患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年制定的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，SLEDAI評(píng)分≥10分，診斷為SLE活動(dòng)期。對(duì)照組選擇年齡與性別匹配，并排除自身免疫疾病的5名健康人。
　　無菌操作下抽取骨髓液10ml，肝素抗凝，利用密度法

4、分離單個(gè)核細(xì)胞，懸浮于成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基后接種于培養(yǎng)皿，放置培養(yǎng)箱中。觀察各組BMSCs的生長(zhǎng)情況、細(xì)胞周期及凋亡情況。方法步驟如下:
　　2.1 BMSCs分離、純化、傳代及鑒定
　　2.2取P3代BMSCs，用含成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)變化:
　　2.2.1繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
　　2.2.2流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
　　2.2.3流式細(xì)胞儀檢

5、測(cè)細(xì)胞凋亡
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析分析各組間細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞周期及凋亡差異的顯著性，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.研究結(jié)果:
　　4.1 BMSCs可以黏附到培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形。待細(xì)胞融合達(dá)80％時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代。BMSCs表型為CD44、CD90和CD105陽性，而CD45、CD34為陰性。傳代后B

6、MSCs增殖迅速，生長(zhǎng)周期縮短。多次（6次）傳代后細(xì)胞表型不發(fā)生變化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和其它結(jié)締組織病組較對(duì)照組BMSCs原代培養(yǎng)所需時(shí)間更長(zhǎng)(P＜0.05)。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，約5-7天可再次傳代，三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.2 BMSCs的細(xì)胞生物學(xué)變化的比較
　　4.2.1分別對(duì)三組培養(yǎng)BMSCs繪制生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞的增長(zhǎng)曲線基本相同，未見明顯的差別;
　　4.2.2通過流式細(xì)胞儀

7、測(cè)定細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)傳代后的BMSCs處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)和原始狀態(tài)的細(xì)胞占絕大多數(shù)。進(jìn)一步將三組BMSCs的S+G2/M期進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)SLE組和其它CTD組，二組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但此兩組明顯高于對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.2.3通過流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)三組培養(yǎng)BMSCs的細(xì)胞凋亡。與正常對(duì)照組比，SLE組和其它結(jié)締組織病組凋亡細(xì)胞數(shù)增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組之間比較，未見