系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓間充質干細胞生長、細胞周期及凋亡相關研究.pdf

1、1.研究目的:
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種免疫功能紊亂的自身免疫性疾病，以多系統(tǒng)或器官病變和血清中出現(xiàn)多種自身抗體為特征，目前發(fā)病機制仍不明確。其中血液學損害為SLE的重要臨床表現(xiàn)，其機制目前也并不十分清楚。
　　骨髓間充質干細胞(BMSCs)是骨髓微環(huán)境中具有多種分化傾向、高度增殖及自我更新能力的非造血性干細胞。能在特定條件下分化為神經(jīng)細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等。BMSCs是造血微環(huán)境中的重要成

2、分，不僅起支持作用，而且分泌細胞因子，調(diào)節(jié)造血細胞增殖分化。針對骨髓間充質干細胞的研究可能會揭示SLE的發(fā)病機理，解釋血液學損害原因。
　　細胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是受到細胞內(nèi)基因及細胞外一些因子調(diào)控的生物學過程。SLE患者BMSCs長期處于紊亂的骨髓微環(huán)境，其自身結構與功能也有一定缺陷。對于SLE患者BMSCs凋亡的研究有利于疾病機制的闡明，以及新療法的探索。
　　2.研究方法:

3、　　本試驗共分為三組:①SLE患者BMSCs組(10人);②其它結締組織病患者BMSCs組（5人）;③正常人（對照組）BMSCs組（5人）。前二組患者均合并血液學損害，取骨髓標本前均未使用激素和免疫抑制劑治療。所有SLE患者均符合美國風濕病學會1997年制定的分類診斷標準，SLEDAI評分≥10分，診斷為SLE活動期。對照組選擇年齡與性別匹配，并排除自身免疫疾病的5名健康人。
　　無菌操作下抽取骨髓液10ml，肝素抗凝，利用密度法

4、分離單個核細胞，懸浮于成人骨髓間充質干細胞完全培養(yǎng)基后接種于培養(yǎng)皿，放置培養(yǎng)箱中。觀察各組BMSCs的生長情況、細胞周期及凋亡情況。方法步驟如下:
　　2.1 BMSCs分離、純化、傳代及鑒定
　　2.2取P3代BMSCs，用含成人骨髓間充質干細胞完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，進行培養(yǎng)。觀察間充質干細胞的生物學變化:
　　2.2.1繪制細胞生長曲線
　　2.2.2流式細胞儀測定細胞周期
　　2.2.3流式細胞儀檢

5、測細胞凋亡
　　3.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析分析各組間細胞培養(yǎng)時間，細胞周期及凋亡差異的顯著性，組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.研究結果:
　　4.1 BMSCs可以黏附到培養(yǎng)皿底部生長，形態(tài)呈長梭形。待細胞融合達80％時可進行細胞傳代。BMSCs表型為CD44、CD90和CD105陽性，而CD45、CD34為陰性。傳代后B

6、MSCs增殖迅速，生長周期縮短。多次（6次）傳代后細胞表型不發(fā)生變化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和其它結締組織病組較對照組BMSCs原代培養(yǎng)所需時間更長(P＜0.05)。傳代后細胞生長旺盛，約5-7天可再次傳代，三組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4.2 BMSCs的細胞生物學變化的比較
　　4.2.1分別對三組培養(yǎng)BMSCs繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)三組細胞的增長曲線基本相同，未見明顯的差別;
　　4.2.2通過流式細胞儀

7、測定細胞周期，發(fā)現(xiàn)傳代后的BMSCs處于相對靜止狀態(tài)和原始狀態(tài)的細胞占絕大多數(shù)。進一步將三組BMSCs的S+G2/M期進行比較。發(fā)現(xiàn)SLE組和其它CTD組，二組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);但此兩組明顯高于對照組，差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.2.3通過流式細胞儀分別檢測三組培養(yǎng)BMSCs的細胞凋亡。與正常對照組比，SLE組和其它結締組織病組凋亡細胞數(shù)增多，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組之間比較，未見