應(yīng)用RQ-RT-PCR方法評(píng)估急性粒細(xì)胞白血病部分分化型（M2）患者M(jìn)RD狀態(tài).pdf

1、目的：探討建立應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-Time QuantitativeReverse Transcription Polymerase chain Reaction，RQ-RT-PCR) 檢測(cè)AML1/ETO融合基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品的方法，并以此作為工具監(jiān)測(cè)急性粒細(xì)胞白血病部分成熟型(M2)患者微小殘留病(Minimal Residual Disease，MRD)的狀態(tài)，為判斷預(yù)后、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、探索強(qiáng)化治療時(shí)機(jī)、最終實(shí)現(xiàn)個(gè)

2、體化治療提供依據(jù)。 方法：1、提取患者標(biāo)本的總RNA，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)特異性引物：2、應(yīng)用定性的RT-PCR在患者標(biāo)本中篩選AML1/ETO融合基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后回收；3、回收的含有目的基因的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒PMD-18T連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM-109；4、將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞接種于AIX選擇性平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)擴(kuò)增，挑取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒；5、以質(zhì)粒為摸板進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)電泳確認(rèn)連接成功的質(zhì)粒提取DNA送

3、寶生物公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)；6、將含有目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ酶切后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，電泳確認(rèn)后測(cè)取OD值，得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品10<'10>拷貝數(shù)；7、應(yīng)用RQ-RT-PCR．驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的性能并對(duì)此方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)；8、對(duì)37例患者骨髓或外周血單個(gè)核標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其中5例患者進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測(cè)；9、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者白血病相關(guān)的免疫表型及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-x<,L>及Bax，并對(duì)1例AML1/ETO融合基因陰性的患者進(jìn)

4、行了跟蹤監(jiān)測(cè)。 結(jié)果：1、調(diào)取目的基因AML1/ETO的片段長(zhǎng)度為402bp，回收并經(jīng)載體擴(kuò)增后測(cè)序確認(rèn)為所需的目的基因；2、構(gòu)建的RNA標(biāo)準(zhǔn)品可以得到線性好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(方程為Y=-3.477*LOG(X)+41.63)，擴(kuò)增效率較高(E=93.9﹪)，融解曲線顯示特異性較好，融解溫度在83℃±1℃，表明標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建成功；3、熒光定量PCR檢測(cè)目的基因AML1/ETO的敏感性為10<'-5>，重復(fù)性較好，批內(nèi)變異為6﹪，批間變異為

5、10﹪，特異性較高； 4、患者初診組及復(fù)發(fā)組的目的基因AML1/ETO的相對(duì)值的平均值高于完全緩解組(CR)，P<0.05，且存在個(gè)體差異；5、隨訪的患者，初診時(shí)目的基因AMLl/ETO的相對(duì)值很高，完全緩解時(shí)降低，復(fù)發(fā)時(shí)明顯升高，初診和CR兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)目的基因AML1/ETO的相對(duì)值相差2個(gè)數(shù)量級(jí)以上病人的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性相對(duì)較小，如果基因AML1/ETO的相對(duì)值持續(xù)升高，提示患者的生存期較短預(yù)后較差；6、經(jīng)治療持續(xù)未緩解的病人跟蹤監(jiān)測(cè)凋亡相

6、關(guān)蛋白Bel-2/Bax表達(dá)比值呈上升趨勢(shì)；7、患者體內(nèi)CD13和HLA-DR表達(dá)穩(wěn)定，且與病情發(fā)展相關(guān)，可作為無(wú)特異性融合基因的患者檢測(cè)MRD的補(bǔ)充手段；8、對(duì)患者21免疫表型跟蹤監(jiān)測(cè)表明在治療過(guò)程中出現(xiàn)了表型漂移。 結(jié)論：RO-RT-PCR方法檢測(cè)AML1/ETO。融合基因的敏感性和特異性較高，可信度和穩(wěn)定性較好：融合基因表達(dá)水平的改變與臨床疾病進(jìn)展關(guān)系一致，對(duì)AML1/ETO融合基因陽(yáng)性的患者M(jìn)RD的定量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于反映