Renca條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)小鼠同種免疫反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)在維持免疫系統(tǒng)的平衡中發(fā)揮重要作用，因此該類細(xì)胞在移植、自身免疫和腫瘤等方面都有潛在的應(yīng)用價(jià)值，雖然在各個(gè)領(lǐng)域中研究和應(yīng)用的目的不同。就移植免疫而言，使用盡可能少甚至不用免疫抑制劑達(dá)到對(duì)主要和次要組織相容性復(fù)合體不同異體組織或器官的長(zhǎng)期耐受一直都是被追求的理想目標(biāo)。天然存在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量稀少僅占CD4+細(xì)胞的5-10％，使其成為治療應(yīng)用的主要障礙，為了克服這一困難，人們研究了通

2、過(guò)體外擴(kuò)增天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)增加數(shù)量，但其不足在于來(lái)源匱乏和耗時(shí)較長(zhǎng)。而CD4+CD25-T細(xì)胞在外周單個(gè)核細(xì)胞所占比重較高，在腫瘤相關(guān)的研究中表明腫瘤來(lái)源的可溶性因子可以將CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。提示我們這有可能是一條獲得治療水平的應(yīng)用于同種移植中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一條新途徑，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文即利用小鼠腎癌細(xì)胞系Renca細(xì)胞的條件培養(yǎng)基通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)此做了探討。
　　 方法：
　　 ⑴Re

3、nca細(xì)胞株購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，BALB/c小鼠和C57BL/6(B6)小鼠，由中山大學(xué)眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所用各品系小鼠均為雄性，體重20±2g。
　　 ⑵在10％FBS+RPMI1640的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)小鼠腎癌細(xì)胞株Renca，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％時(shí)，換用無(wú)血清RPMI1640的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集上清夜，1500rpm離心5 min，取上清超濾除菌，保存于-70℃冰箱中備用。
　　 ⑶斷頸處

4、死BALB/c小鼠，取脾臟，F(xiàn)icoll分離獲得單個(gè)核細(xì)胞；通過(guò)小鼠CD4+T細(xì)胞磁珠分離試劑盒，陰性選擇獲得CD4+T細(xì)胞；再次陽(yáng)性選擇獲得CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)分析細(xì)胞純度。其中后者作為細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)用；前者用作陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。
　　 ⑷Foxp3 mRNA Real Time RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)收集細(xì)胞加入1ml Trizol試劑。勻漿后，用氯

5、仿進(jìn)行二相分離，溶解至水相的RNA用異丙醇沉淀，離心后清洗RNA沉淀。標(biāo)本RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。標(biāo)本的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Real time RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，F(xiàn)oxp3為40個(gè)PCR循環(huán)(95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s)，GAPDH為40個(gè)PCR循環(huán)(95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s)。熒光定量結(jié)果以Foxp3/GAPDH的CT比值表示。
　　 ⑸細(xì)胞因

6、子等效性實(shí)驗(yàn)根據(jù)初始條件培養(yǎng)基中所含IL-10和TGF-β濃度，換算出轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)各組相應(yīng)的終濃度，分別加入重組的小鼠IL-10和TGF-β，使孔內(nèi)這兩個(gè)細(xì)胞因子的終濃度與轉(zhuǎn)化培養(yǎng)時(shí)相同，加入與方法4同等量的抗小鼠CD28、IL-2，混勻后放入37.0℃、5％CO2、95％濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在培養(yǎng)的第4、第6d半量換液，換除培養(yǎng)基以1200rpm離心5min，加入含同樣濃度細(xì)胞因子，加入各孔混勻繼續(xù)培養(yǎng)，第7天收集細(xì)胞。同1.4方

7、法檢測(cè)細(xì)胞表型。
　　 ⑹以Balb/c小鼠脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，以C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞。經(jīng)25μg/ml的絲裂霉素滅活刺激細(xì)胞。反應(yīng)和刺激細(xì)胞均調(diào)整濃度為1×106/ml。刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞按1∶1比例進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)體系中加入經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后再次分選的CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞，與反應(yīng)細(xì)胞的比例分別為4∶1，0∶1，1∶1和1∶4，混勻后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，加入CCK-8后繼續(xù)培養(yǎng)6-8h后

8、，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)在450nm波長(zhǎng)的吸光度。
　　 ⑺組織病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色于術(shù)后第10 d取皮膚移植物及周圍組織，用10％甲醛固定后行石蠟包埋、切片及HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組標(biāo)本的組織病理學(xué)改變。將石蠟包埋的移植物組織切成5μm厚的切片，脫蠟至水，經(jīng)消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及抗原復(fù)性處理后，進(jìn)行免疫組化染色。染色參照免疫組化二步法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，蘇木素復(fù)染后封片。顯微鏡400倍率下，在每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)

9、數(shù)Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞，換算為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/mm2進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 ⑻使用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以X±s表示，組間差異的多重比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)。移植皮瓣生存時(shí)間采用采用Kaplan-Meier生存曲線分析并用秩和檢驗(yàn)(1og-rank test)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，即p＜0.05為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 ①取BALB/c小鼠的脾細(xì)胞，采用MACS方法

10、分選CD4+CD25-T細(xì)胞，分選后經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定其純度＞88％。CD4+CD25-T細(xì)胞培養(yǎng)5 d后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定比例范圍(3∶1)內(nèi)隨著R-CM的比例增加，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在培養(yǎng)體系中所占的比例也相應(yīng)增加，在含75％的R-CM中達(dá)到最高，CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+Foxp3+T細(xì)胞分別為(21.52±1.88)％和(11.85±0.82)％，然而在完全R-CM中培養(yǎng)體系中CD4+CD25+和C

11、D4+Foxp3+T細(xì)胞的比例又呈下降趨勢(shì)它們分別是(16.47±1.56)％和(5.52±0.35)％，但仍高于無(wú)R-CM的培養(yǎng)體系中的比例(P＜0.05)。
　　 ②培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞Foxp3基因的表達(dá)隨著條件培養(yǎng)基在混合培養(yǎng)基中的比例增加，F(xiàn)oxP3的表達(dá)水平逐漸增加，而在含有75％的Renca條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CD4+CD25-T細(xì)胞該基因表達(dá)水平最高，與對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比有明顯差別(p＜0.05)，隨后在完全Re

12、nca條件培養(yǎng)基中細(xì)胞該基因的表達(dá)又呈較低水平。
　　 ③培養(yǎng)基中相同濃度的重組IL-10和TGF-β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比低于對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基組結(jié)果顯示在對(duì)應(yīng)的含有相同濃度的重組IL-10和TGF-β各培養(yǎng)組CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+FoxP3+T細(xì)胞的百分率分別是(4.24±0.20)％、(5.28±0.57)％、(6.88±0.41)％和(9.07±0.40)％及(1.83±0.

13、06)％、(2.02±0.70)％、(2.04±0.78)％和(4.21±1.12)％，明顯低于對(duì)應(yīng)于RPMI1640：Renca條件培養(yǎng)基分別為3∶1、1∶1、1∶3和0∶1的各培養(yǎng)組的各組結(jié)果(p＜0.05)。
　　 ④將被轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)T細(xì)胞按不同比例加入單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示：隨著參與共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例增加(0∶1、4∶1、1∶1和1∶4)，各組細(xì)胞的吸光度逐漸降低，在0∶1組為0.71±0.036

14、，在1∶4組則為0.2±0.049，表明該細(xì)胞能降低反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖能力，并且呈比例依賴性，各組相比P＜0.05。
　　 ⑤從每組小鼠中各取8只用于記錄生存時(shí)間并繪制生存曲線，結(jié)果顯示：無(wú)論是在轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組(29.6±1.4 d)還是新鮮分離的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組(28.0±1.0 d)，其受體小鼠的皮膚移植物的存活時(shí)間均明顯長(zhǎng)于未處理組(9.8±0.6 d)和PBS處理組(10.9±0.6 d)(P＜0.05)，甚

15、至長(zhǎng)于雷帕霉素組(19.9±0.6 d)(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組和新鮮分離的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組在移植物存活時(shí)間方面無(wú)明顯差異(P＞0.05)，在同系同基因移植組，移植皮片均永久存活。
　　 ⑥在皮膚移植后第15 d對(duì)受體兩足掌腫脹度測(cè)量的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組的小鼠對(duì)供體C57BL/6脾細(xì)胞反應(yīng)(0.29±0.071 mm)與未處理組(1.04±0.075 mm)和PBS處理組(1.00±0.12

16、2 mm)相比明顯較輕微(P＜0.05)，與天然的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組(0.29±0.035 mm)相似，而雷帕霉素處理組受體足掌的腫脹度介于兩者之間(0.42±0.1 mm)。
　　 ⑦在術(shù)后第10 d取受體移植皮片及其周圍組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。鏡下可見(jiàn)在未處理組和PBS處理組移植物表皮層壞死，真皮層結(jié)構(gòu)紊亂，前者彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，后者見(jiàn)膠原纖維壞死，未見(jiàn)毛囊及血管結(jié)構(gòu)。雷帕霉素組皮下組織及毛囊周圍淋巴細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，部分

17、膠原纖維排列紊亂，表皮脫落，表明能抑制局部排斥反應(yīng)。在其余3組可見(jiàn)完整的表皮及真皮結(jié)構(gòu)，其中在轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組可見(jiàn)到較為密集的小血管和少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以毛囊周圍較明顯，其表現(xiàn)與同系同基因移植組相似，而在天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處理組仍可見(jiàn)到較多的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 結(jié)論：⑴Renca條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)化作用是通過(guò)Renca細(xì)胞所產(chǎn)生的包括IL-10和TGF-β在內(nèi)的多