人食管鱗癌放射抗性細(xì)胞系TE13R120的放射抗性一上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究.pdf

1、目的:比較人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TE13及經(jīng)放射線照射篩選出的放射抗性細(xì)胞株TE13R120細(xì)胞中E-cadherin、vimentin的表達(dá)水平，研究上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與食管癌放射抗拒性的關(guān)系。
　　方法:分別常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TE13和經(jīng)放射線照射篩選出的放射抗性細(xì)胞株TE13R120細(xì)胞，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用細(xì)胞劃痕實驗

2、比較兩種細(xì)胞的侵襲、遷移能力。應(yīng)用實時定量熒光PCR方法(Real Time PCR)檢測兩種細(xì)胞中上皮表型標(biāo)志物E鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、間質(zhì)表型標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin，VIM)的表達(dá)水平，并進(jìn)一步應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry,ICC)方法半定量驗證兩種細(xì)胞中E鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異:取對數(shù)生長期的單層細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡

3、下觀察TE13細(xì)胞、TE13R120細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異。TE13細(xì)胞多呈片狀生長，細(xì)胞之間連接緊密，界限不夠清楚;TE13R120細(xì)胞輪廓較清晰，細(xì)胞連接不緊密，呈梭形或紡錘體形，細(xì)胞細(xì)長，大小不一，排列紊亂無規(guī)律，形態(tài)不規(guī)則。
　　2 TE13細(xì)胞及TE13R120細(xì)胞放射敏感性的差異:（此部分實驗參照我課題組楊延靈的實驗結(jié)果）細(xì)胞克隆實驗測得兩種細(xì)胞生物學(xué)參數(shù)，TE13R120細(xì)胞的D0、Dq和N值與親代細(xì)胞TE13相比均增大，

4、α/β比值降低，提示TE13R120較其親本細(xì)胞更具放射抗性;2 Gy時存活分?jǐn)?shù)SF2是代表細(xì)胞放射敏感性的重要指標(biāo)，SF2越大，放射抗拒性越強(qiáng)，TE13R120細(xì)胞的SF2值高于親代細(xì)胞TE13，進(jìn)一步說明TE13R120細(xì)胞的放射抗性增強(qiáng)。
　　3放射抗性細(xì)胞TE13R120細(xì)胞周期延長:連續(xù)8天計數(shù)24孔板中的細(xì)胞數(shù)，繪制出TE13細(xì)胞和TE13R120細(xì)胞的半對數(shù)生長曲線，從細(xì)胞生長曲線圖可以看出，TE13R120細(xì)胞的生

5、長速率較TE13細(xì)胞慢，TE13R120細(xì)胞的群體倍增時間為(20.70±0.57)h，長于親代細(xì)胞TE13細(xì)胞的(17.67±0.99)h，(P=0.024)。
　　4 TE13細(xì)胞、TE13R120細(xì)胞侵襲、遷移能力的比較:于滅菌六孔板中以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)兩種細(xì)胞至快鋪滿單層時進(jìn)行細(xì)胞劃痕，換為無血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后6h、12h、24h在倒置顯微鏡下觀察劃痕中細(xì)胞侵襲遷移情況并拍照。發(fā)現(xiàn)12h、24h時劃痕中TE13R120

6、細(xì)胞較TE13細(xì)胞數(shù)多，24h時TE13細(xì)胞遷移距離為(97.18±3.04) um，TE13R120細(xì)胞遷移距離為203.52(40.42) um，（P=0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TE13R120細(xì)胞較TE13細(xì)胞侵襲與遷移能力增強(qiáng)。
　　5 TE13細(xì)胞經(jīng)射線照射后發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）:TE13細(xì)胞經(jīng)射線照射至120 Gy，細(xì)胞形態(tài)由均勻的多邊形向大小不等的細(xì)長、紡錘體形變化;實時定量PCR法檢測兩種細(xì)胞中上皮

7、間質(zhì)標(biāo)志物E-cad、Vimentin的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參，TE13R120細(xì)胞較TE13細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物E-cad表達(dá)降低，（P=0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;TE13R120細(xì)胞較TE13細(xì)胞間質(zhì)表型標(biāo)志物波形蛋白Vimentin表達(dá)升高，(P=0.030)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測TE13細(xì)胞、TE13R120細(xì)胞中E-cad蛋白和Vimentin蛋白表達(dá)情況:兩種蛋白在TE13細(xì)胞和TE13

8、R120細(xì)胞的表達(dá)主要定位于胞漿和胞核中，TE13細(xì)胞中E-cad蛋白的陽性表達(dá)高于TE13R120細(xì)胞，Vimentin蛋白的陽性表達(dá)則低于TE13R120細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1通過電離輻射反復(fù)照射食管鱗狀細(xì)胞癌TE13細(xì)胞可篩選出放射抗性細(xì)胞系TE13R120細(xì)胞，TE13R120細(xì)胞較TE13細(xì)胞倍增時間延長，具有穩(wěn)定的放射抗性表型。
　　2放射抗性食管癌細(xì)胞TE13 R120細(xì)胞侵襲、遷移能力增強(qiáng)。