EndMT在高PTH血癥介導的CKD心血管病變中的作用及機制研究.pdf

1、目的:心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)最常見的嚴重并發(fā)癥，也是導致該類患者死亡的首位病因。隨著腎功能的下降，CKD患者常出現(xiàn)血清甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)水平異常升高的現(xiàn)象。既往，臨床和基礎研究結果已經(jīng)證實，高PTH血癥可誘導心臟纖維化病變和血管鈣化的形成，是CVD發(fā)生率和死亡率增加的獨立危險因素;但

2、其具體機制仍不十分清楚。近年來，研究證實內皮細胞間充質轉分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）是介導心臟纖維化進展的重要細胞學機制，且發(fā)生EndMT的細胞可獲得間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)表型并分化為骨樣細胞參與異位鈣化病變的形成。因此，本研究擬通過體內外實驗觀察EndMT是否參與介導高PTH血癥相關CKD心臟纖維化和血管鈣化的形成，并初步探討

3、上述細胞轉化過程的潛在分子機制。
　　方法：在第一部分實驗中，我們首先構建腺嘌呤誘導的慢性腎功能衰竭(chronic renalfailure，CRF)模型大鼠，檢測了該模型大鼠在接受西那卡塞（cinacalcet, CINA）降PTH治療后心臟纖維化病變及EndMT相關標志物的表達水平，并觀察PTH對體外培養(yǎng)的人主動脈內皮細胞(HAECs) EndMT標志物表達的影響;在第二部分，我們通過體外實驗觀察經(jīng)典的Wnt/β-caten

4、in徑路活化在PTH所誘導EndMT中的作用;在第三部分實驗中，我們分別在CRF大鼠模型和PTH灌注的內皮細胞示蹤小鼠(Tie2-Cre×Tmt mice)模型中觀察主動脈鈣化與內皮-軟骨細胞相關標志物的表達，并在體外實驗中檢測PTH對EndMT后軟骨細胞分化潛能的影響。在第四部分，我們在體外實驗中應用β-catenin siRNA和Wnt通路抑制劑DKK1部分阻斷PTH誘導的EndMT，觀察其對細胞MSC標志物和軟骨細胞分化潛能的影響

5、。
　　結果：第一部分實驗結果顯示，與對照組相比，CRF組大鼠血肌酐、尿素氮和尿蛋白含量顯著升高，提示CRF造模成功。與對照組相比，CRF組大鼠血PTH和血磷水平顯著增加，而血鈣水平則顯著降低。CINA治療后，CRF大鼠血PTH水平顯著下降。而血鈣、血磷濃度和鈣磷乘積則與治療前無顯著統(tǒng)計學差異。此外，CRF組大鼠心臟纖維化病變程度和EndMT相關標志物的表達水平較對照組顯著增加;而CINA治療后，上述指標的表達亦明顯下調。隨后，體

6、外實驗發(fā)現(xiàn)，HAECs表達PTH受體，PTH呈濃度及時間依賴性的上調HAECs間充質標志蛋白FSP1和α-SMA的表達水平，同時下調內皮細胞標志蛋白CD31的表達水平。第二部分實驗結果顯示，高濃度PTH誘導HAECs發(fā)生β-catenin核轉位;應用β-catenin siRNA或DKK1干預可部分阻斷PTH所誘導的EndMT相關標志物的表達。第三部分實驗結果顯示，CRF組大鼠主動脈中膜鈣化面積較對照組顯著增加，并伴隨EndMT相關標志

7、物、MSC和軟骨細胞標志蛋白的表達增加;而接受CINA降PTH治療的CRF模型大鼠主動脈中膜鈣化病變則較CRF模型組大鼠顯著減輕，同時，EndMT相關標志物和MSC、軟骨細胞標志蛋白的表達均下調。給予內皮細胞熒光示蹤小鼠超生理劑量的PTH灌注后，模型組小鼠主動脈壁內出現(xiàn)鈣化斑，并表達軟骨細胞標志物;同時，內皮細胞示蹤熒光不僅出現(xiàn)在主動脈內壁內皮細胞層，同樣出現(xiàn)在主動脈內膜下及中膜層，且部分細胞共表達軟骨細胞標志蛋白。此外，體外實驗結果顯

8、示，超生理劑量PTH誘導內皮細胞EndMT相關標志物表達上調的同時MSC相關標志物的表達水平亦明顯升高;后者接受軟骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7-14天后，軟骨細胞標志蛋白、軟骨基質和細胞鈣含量均顯著增加。第四部分實驗結果顯示，應用β-catenin siRNA和DKK1抑制高濃度PTH誘導的EndMT后，MSC標志物的表達水平下調，在軟骨細胞誘導培養(yǎng)后，軟骨細胞標志蛋白水平也顯著下降。
　　結論：1.在CKD進展過程中，高濃度的PTH可通過誘導