Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MGC803細胞系的構建.pdf

1、目的：
　　 構建靶向Cbl-b基因的短發(fā)夾環(huán)RNA（shRNA）真核質(zhì)粒表達載體，并轉(zhuǎn)染至MGC803胃癌細胞中，用G418進行篩選，建立Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MGC803細胞株，并進行檢測。利用這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌MGC803細胞系，進行Cbl-b調(diào)節(jié)EGFR信號轉(zhuǎn)導通路的相關研究。
　　 方法：
　　 1、引物設計
　　 根據(jù)Cbl-b基因序列，通過軟件設計三個靶序列，利用BLAST進行同源

2、性分析，設計出2組Cbl-b shRNA序列及1組對照靶序列。shRNA排列順序均為：BamH Ⅰ酶切位點+反義序列+loop+正義序列+TC+HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位點+正義序列+loop+反義序列+AG+HindⅢ。
　　 2、構建Cbl-b ShRNA質(zhì)粒
　　 選用pRNA-U6.1/Neo（Genscript，Piscatcway）作為載體?；瘜W合成法合成shRNA序列，將配對的單鏈合成雙鏈，采用Bam-

3、HI/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進行酶切后，以T4連接酶連接于同樣經(jīng)過采用Bam-HI/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進行酶切后的pRNA-U6.1/Neo載體內(nèi)。將構建成的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌DH5α中，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，篩選陽性菌落。
　　 3、測序
　　 對構建完畢的質(zhì)粒進行測序，通過檢測結(jié)果可以看出三段引物均成功插入質(zhì)粒內(nèi)。測序確認后進行大量復制、擴增，提取重組質(zhì)粒。
　　 4、基因轉(zhuǎn)染

4、　　 用含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC803胃癌細胞。將對數(shù)生長期的細胞于轉(zhuǎn)染前24小時，按每孔1×104個細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，當細胞達85-95％時按照，Lipofectamine 2000說明書進行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，換為G418培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后，顯微鏡觀察后，挑選克隆。
　　 5、Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞中Cbl-b的表達
　　 收集轉(zhuǎn)染后細胞進行裂解，提取細胞蛋白

5、，取20μg處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶封閉1h，一抗孵育1h，TBST洗膜，然后二抗孵育30min，TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液，孵育5min，暗室中用X片曝光，顯影，定影。以未轉(zhuǎn)染細胞系和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞系作為對照，選取表達率為對照組10％以下的細胞株為陽性細胞株。
　　 6、MTT法檢測四種胃癌細胞的增殖
　　 取對數(shù)期生長的未轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞，轉(zhuǎn)染后的空白對

6、照，Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細胞，進行胰蛋白酶消化，消化后用培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至3×104個/ml，按每孔200μl接種于96孔板，37℃分別培養(yǎng)24h，48h，72h后，加入MTT，于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO，在恒溫振蕩器上振蕩10min，室溫20min孵育。放入酶標儀中以490nm波長檢測光密度值（optical density，OD）?？瞻渍{(diào)零組A490的OD值均數(shù)設為零，以平行孔的平均O

7、D值作為各組的OD值。
　　 7、Western Blot檢測沉默Cbl-b后對P-ERK及p-AKT的影響
　　 收集轉(zhuǎn)染后三種細胞及未轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞進行Western Blot檢測，分別加入抗AKT及抗ERK抗體孵育1h，TBST洗膜，二抗孵育，洗膜，加入ECL發(fā)光液，孵育5min，曝光，顯影，定影。以未轉(zhuǎn)染細胞系和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞系作為對照，比較AKT及ERK表達的變化。
　　 結(jié)果：
　

8、　 1、設計pRNA-U6.1/Neo-cbl靶序列和空白對照序列
　　 根據(jù)Cbl-b基因序列，設計Cbl-b靶序列2組（shRNA414，shRNA852）進行同源性分析，設計出2組Cbl-b shRNA序列及1組對照靶序列。
　　 2、測序
　　 結(jié)果表明shRNA414，852，和空白對照模板成功構建于pRNA-U6.1/Neo載體上，序列完全正確，與目的序列相同。
　　 3、空白對照組和Cbl

9、-b基因沉默胃癌MGC803細胞系篩選
　　 利用Western Blot檢測，選取與未轉(zhuǎn)染的MGC-803細胞Cbl-b表達水平相同的，轉(zhuǎn)染空白對照組細胞為對照組細胞，選取Cbl-b表達水平為未轉(zhuǎn)染組的10％以下的細胞系為Cbl-b基因沉默細胞系。
　　 4、對照組和Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細胞增殖
　　 通過進行MTT檢測，發(fā)現(xiàn)在細胞增殖24h后，Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細胞（shRNA4

10、14，shRNA852）增殖逐漸增快，與空白對照及未轉(zhuǎn)染細胞比較差異顯著。
　　 5、沉默Cbl-b后對p-ERK及p-AKT的影響
　　 通過Western Blot檢測，在Cbl-b基因沉默細胞中，p-AKT表達較未轉(zhuǎn)染細胞和空白對照細胞明顯上調(diào)。而在p-ERK表達方面，四種細胞無明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構建泛素連接酶Cbl-b ShRNA質(zhì)粒。
　　 2、成功建立Cbl-b被