豬瘟C株疫苗免疫前后CD4+T細(xì)胞αβTCR的多樣性及寡克隆化研究.pdf

1、T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）是表達(dá)于T細(xì)胞表面的異二聚體復(fù)合物，是T細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中αβTCR識別由主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex, MHC）分子遞呈的抗原肽。TCRα鏈和β鏈均有三個互補決定區(qū)（complementary determining regions, CDRs）–CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3區(qū)與抗原肽識別和結(jié)合有關(guān)，不同

2、的CDR3序列代表不同的T細(xì)胞克隆，即一種CDR3序列就是一種T細(xì)胞克隆，因此通過監(jiān)測CDR3的譜型變化可以反映 T細(xì)胞的克隆性。目前，由于基因掃描-譜型分析技術(shù)具有快速、敏感和高效的特點，已作為腫瘤、病毒感染、自身免疫病及移植排斥反應(yīng)中檢測T細(xì)胞TCR CDR3譜型變化的常規(guī)技術(shù)，現(xiàn)已成功揭示了機(jī)體免疫穩(wěn)定狀態(tài)下及臨床疾病狀態(tài)下αβTCR的變化規(guī)律，并將抗原特異的TCR基因用于免疫治療中，已取得了一定的成果。迄今為止，國內(nèi)外對豬T細(xì)胞

3、TCR在病原感染和疫苗免疫狀態(tài)下的研究很少，但豬的免疫學(xué)尤其是T細(xì)胞免疫機(jī)制的研究不僅有助于豬病防控，也有助于人類異體器官移植。因此，本研究主要利用基因譜型分析技術(shù)研究臨床健康豬T細(xì)胞αβTCR基因的多樣性及豬瘟C株疫苗免疫后CD4+ T細(xì)胞αβTCR的寡克隆性，為深入研究豬瘟病毒感染的細(xì)胞免疫機(jī)制以及豬瘟新型疫苗的研制提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)。本研究取得的主要進(jìn)展如下：
　　1.成功分析了臨床健康豬CD4+和CD8+T細(xì)胞TCRα鏈和

4、β鏈基因家族CDR3區(qū)譜型及長度多樣性。采用RT-PCR基因掃描分析技術(shù)從健康豬CD4+和CD8+T細(xì)胞中克隆了豬的19個TCR AV和20個TCR BV基因家族。譜型分析結(jié)果表明，19個TCR AV和20個TCR BV基因家族在兩類細(xì)胞亞群中均有表達(dá)，且每個家族的譜型均呈典型的高斯分布，多數(shù)家族含有八種以上不同長度的CDR3序列，相鄰CDR3序列間一般相差3 bp，表明健康狀態(tài)下T細(xì)胞受體 CDR3區(qū)具有長度和序列多樣性。此外，同一T

5、CR家族在兩種T細(xì)胞亞群的表達(dá)頻率不同，即使是同一細(xì)胞亞群，不同家族的表達(dá)水平也有差異。這種臨床健康豬CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞αβTCR的多樣性有利于機(jī)體識別各種抗原肽，以維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　2.成功分析了豬瘟C株疫苗免疫后豬CD4+ T細(xì)胞αβTCR的變化規(guī)律。以豬瘟C株疫苗免疫4頭同窩合作小型豬，利用基因掃描–譜型分析技術(shù)分析免疫前后 CD4+ T細(xì)胞 TCR各家族CDR3區(qū)譜型變化。結(jié)果顯示，大多數(shù)譜型變化的家

6、族在免疫后第3天即抗體產(chǎn)生之前就出現(xiàn)克隆性擴(kuò)增的變化，且這種克隆化趨勢達(dá)到高峰后逐漸減退，直至免疫后第15天TCR的譜型又恢復(fù)到了免疫前的高斯分布。＃884豬TCR AV14、AV38和TCR BV6S，#888豬TCR AV8-3S和TCR BV30，#892豬TCR AV5S、AV8-3S、AV8-4S、AV14和TCR BV4S、BV7S、BV15家族呈現(xiàn)單寡克隆化增殖趨勢。其中，TCR AV14在#884和#892豬，TCR A

7、V8-3S在#888和#892豬均呈克隆化表達(dá)，且TCR AV5S、AV38和TCR BV6S在豬瘟病毒C株感染的外周血單個核細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，表明PBMCs和CD4+T細(xì)胞可能對豬瘟病毒同一抗原肽產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。
　　3.成功分析了豬瘟C株疫苗免疫的呈克隆性擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞TCR AV和BV家族CDR3的保守氨基酸基序。RT-PCR擴(kuò)增上述TCR基因家族的CDR3區(qū)并進(jìn)行克隆測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)盡管同一基因家族CDR3序

8、列不完全相同，但其都含有保守的氨基酸序列。所有呈克隆性擴(kuò)增的TCR AV家族CDR3區(qū)均含有“LX”基序，BV家族具有保守的“GGA”基序。這些保守的CDR3氨基酸基序可能與豬瘟病毒抗原肽識別和結(jié)合有關(guān)，這為豬瘟多肽疫苗的高通量篩選和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　4.成功擴(kuò)增了豬瘟病毒C株特異的TCR AV5S和TCR BV6S全長基因序列，在序列分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了兩個真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行共轉(zhuǎn)染表達(dá)研究?；蛐蛄蟹治霰砻鳎寺〉腡CR AV