Sema3A參與前列腺癌介導(dǎo)的促成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　超過90％的惡性腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,而且其中超過90%的死因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。骨骼系統(tǒng)是腫瘤患者體內(nèi)瘤細(xì)胞的常發(fā)轉(zhuǎn)移部位。前列腺癌和乳腺癌是轉(zhuǎn)移性腫瘤的常見病因。此外,其他類型腫瘤如肺癌、腎臟及甲狀腺腫瘤也會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。晚期腫瘤轉(zhuǎn)移至骨將會(huì)引起一些嚴(yán)重的并發(fā)癥,比如嚴(yán)重的骨痛,通常這類疼痛對(duì)治療不敏感,還有脊髓壓迫、病理性骨折和高鈣血癥。前列腺癌患者多死于腫瘤轉(zhuǎn)移性骨疾病(Metastatic bone d

2、isease,MBD),這類疾病通過放射顯影技術(shù)觀察通常會(huì)表現(xiàn)出明顯的對(duì)骨組織呈成骨性,而非溶骨性的破壞。這通常是由于前列腺癌細(xì)胞侵入至骨髓微環(huán)境,影響了骨形成和骨吸收的平衡,且介導(dǎo)了成骨細(xì)胞的過度活化所造成的。
　　大量的研究發(fā)現(xiàn),骨轉(zhuǎn)移后的前列腺癌細(xì)胞通過分泌促成骨性因子刺激成骨前體細(xì)胞活化。WNT信號(hào)因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等信號(hào)蛋白能夠促進(jìn)各種成骨前體細(xì)胞,如MC3T3-E1(鼠源性前體成骨細(xì)

3、胞亞克隆系)細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向成熟成骨細(xì)胞分化。WNT信號(hào)蛋白是一種糖脂類信號(hào)分子,通過目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白β-catenin發(fā)揮促進(jìn)成骨成熟的作用。β-catenin最早發(fā)現(xiàn)其參與α-catenin以及cadherin的黏著連接,但此后因作為WNTs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)共活化因子而被廣泛熟知。經(jīng)典WNT配體通過與其受體復(fù)合物,包括FZD蛋白家族的七次跨膜受體以及LRP5或LRP6,激活WNT/β-catenin信號(hào)通路,

4、來自WNTs的信號(hào)能夠抑制β-catenin的降解,保證后者呈穩(wěn)定狀態(tài),并能夠轉(zhuǎn)位至胞核與TCF/LEF蛋白結(jié)合,進(jìn)而激活WNTs目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。此外,WNT配體還能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中BMP2的表達(dá),后者被證明同樣對(duì)成骨分化有重要的促進(jìn)作用。由此可見WNT/β-catenin對(duì)成骨分化起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。但前列腺癌細(xì)胞通過分泌何種促成骨因子進(jìn)而調(diào)節(jié)WNT/β-catenin通路參與促成骨作用的相關(guān)機(jī)制研究并不透徹。
　　近期有研究發(fā)

5、現(xiàn),Semaphorins家族中Semaphorin3A(Sema3A),能夠刺激成骨性的骨礦化,表現(xiàn)出明顯的骨保護(hù)特性,其生物學(xué)功能的發(fā)揮是依靠與其特異性受體NRP1連接而實(shí)現(xiàn)的。但目前仍然缺乏前列腺癌細(xì)胞是否通過分泌Sema3A介導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)WNT/β-catenin通路進(jìn)而促進(jìn)成骨分化的相關(guān)研究。
　　研究方法:
　　我們觀察不同前列腺癌細(xì)胞對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化的影響,為后續(xù)機(jī)制學(xué)研究建立前列腺癌與成

6、骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)模型,并檢測各型前列腺細(xì)胞系中Sema3A表達(dá)的差異。而后,我們著重研究前列腺癌細(xì)胞C4-2是否能夠分泌Sema3A參與促成骨分化的機(jī)制。最后,我們檢測前列腺癌細(xì)胞來源的Sema3A對(duì)成骨前體細(xì)胞內(nèi)WNT/β-catenin信號(hào)通路,重點(diǎn)是對(duì)β-catenin活化的影響。
　　一、體外共培養(yǎng)模型的建立以及各型前列腺癌細(xì)胞系中Sema3A的表達(dá)差異
　　1.收集各前列腺癌細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基(CM),分組,分別刺

7、激成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分化。分別于實(shí)驗(yàn)第3天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞測定堿性磷酸酶(ALP)活性,并做ALP染色,第14或第21天利用茜素紅染色觀察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞礦化成熟程度;并在實(shí)驗(yàn)第14天利用qPCR技術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成骨相關(guān)標(biāo)志性基因Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.利用Western-blot蛋白印跡分析以及細(xì)胞免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察各型前列腺癌細(xì)胞系中Sema3

8、A的表達(dá)差異。
　　二、Sema3A/NRP1在前列腺癌介導(dǎo)的促成骨分化中作用機(jī)制的研究
　　利用攜帶干擾Sema3A表達(dá)shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系C4-2(該細(xì)胞系在前述實(shí)驗(yàn)中被證明能夠明顯促進(jìn)成骨分化),或Sema3A特異性中和抗體處理其CM,制備如下4種條件培養(yǎng)基:C4-2成骨條件培養(yǎng)基、C4-2-Sema3A成骨條件培養(yǎng)基、C4-2NC成骨條件培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,或另外4種:C4-2成骨條件培養(yǎng)基, C

9、4-2Sema3A Ab成骨條件培養(yǎng)基, C4-2IgG成骨條件培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。進(jìn)過共培養(yǎng)3天或14天,收集實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
　　1.利用ALP活性檢測和BCIP/NBT染色法檢測各組細(xì)胞ALP活性。
　　2.利用茜素紅S染色檢測各種細(xì)胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況。
　　3.利用qPCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　4.利用Western-blot

10、蛋白印跡法檢測實(shí)驗(yàn)細(xì)胞表面Sema3A特異性受體NRP1的表達(dá),以及細(xì)胞質(zhì)中活性狀態(tài)的β-catenin的表達(dá)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、體外共培養(yǎng)模型的鑒定
　　1. C4-2細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠顯著促進(jìn)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1中ALP的活化以及礦化形成程度(P<0.05)。相反PC-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)上述過程卻呈抑制作用(P<0.05)。
　　2.含C4-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基(20%,v/v

11、)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中成骨相關(guān)標(biāo)志基因Col1α1, OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。
　　二、Sema3A的表達(dá)
　　1.細(xì)胞免疫熒光檢測:
　　使用Sema3A的特異性一抗以及標(biāo)記FITC熒光素的二抗探針檢測各型前列腺癌細(xì)胞系中的Sema3A,其中C4-2細(xì)胞中指示Sema3A表達(dá)的綠色熒光最明顯。
　　2.Western-blot蛋白

12、印跡法:
　　抽提各型前列腺癌細(xì)胞系的總蛋白,并利用Sema3A特異性抗體檢測其表達(dá)。其中,C4-2細(xì)胞中Sema3A蛋白印跡灰度值最高。
　　三、Sema3A/NRP1在前列腺癌介導(dǎo)的促成骨分化中作用機(jī)制的研究1.成骨分化:
　　1)堿性磷酸酶的活性:與陽性對(duì)照組相比,C4-2條件培養(yǎng)基處理過后MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)(P<0.05),但在使用慢病毒靜默Sema3A在C4-2細(xì)胞中表達(dá),或是使用中和

13、抗體下調(diào)Sema3A在C4-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基中含量后,其與正常對(duì)照相比,無顯著差異。
　　2)礦化實(shí)驗(yàn):使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,先前因使用C4-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)而大量形成的骨鈣化結(jié)節(jié)又明顯減少,而且骨鈣化面積也明顯縮小(P<0.05)。
　　3)成骨相關(guān)基因表達(dá):C4-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基可促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA高表達(dá)(P<0.05),但使用s

14、hRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,上述成骨相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量與陽性對(duì)照組相比無明顯差異。
　　2.特異性受體NRP1在成骨細(xì)胞表面的表達(dá):
　　使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,NRP1在MC3T3-E1表面表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。
　　3.MC3T3-E1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的活化檢測:
　　成骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的活化受C4-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基

15、影響,在共培養(yǎng)0h、48h及96h后利用Wester-blot法檢測蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)β-catenin的活化呈時(shí)間依賴性增強(qiáng),與刺激時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,在成骨誘導(dǎo)過程中MC3T3-E1細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定活化狀態(tài)的β-catenin表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　一、Sema3A在高轉(zhuǎn)移性的、具有明顯促成骨活性的前列腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。