布拉氏酵母URA3-TRP1雙營(yíng)養(yǎng)缺陷株的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、布拉氏酵母(S.boulardii)是法國(guó)科學(xué)家Henri Boulard于1920年從印尼荔枝等水果中分離得到的一種益生酵母菌。自從1982年DuCluzeau等首先報(bào)道了布拉氏酵母的益生性后，布拉氏酵母作為益生菌就得到了廣泛的研究?，F(xiàn)在布拉氏酵母已被廣泛的用作預(yù)防和治療腹瀉及腸道菌群失調(diào)的藥物。布拉氏酵母作為益生菌，雖然有很好的益生作用，但其不能在腸道內(nèi)定植等缺陷也嚴(yán)重限制了其更廣泛的應(yīng)用。
　　基因敲除技術(shù)在生物遺傳操作方面

2、的應(yīng)用得到了人們的廣泛認(rèn)可。應(yīng)用該技術(shù)可以在分子水平上研究基因的功能，改造生物的遺傳性狀。對(duì)于布拉氏酵母而言，我們可以通過基因敲除技術(shù)，對(duì)其遺傳性狀加以改造，以期獲得能夠在腸道內(nèi)定植、益生作用更好的菌株，從而大大提高其應(yīng)用范圍。
　　在近些年關(guān)于布拉氏酵母的研究報(bào)道中，主要集中于其在生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究，很少是關(guān)于其分子機(jī)制的研究。由于布拉氏酵母生活史的特異性，它不能形成單倍體的孢子，也沒有天然的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，這就使得已經(jīng)成熟應(yīng)用

3、于釀酒酵母的遺傳操作系統(tǒng)不能直接應(yīng)用到布拉氏酵母中。因而，在對(duì)布拉氏酵母的遺傳操作過程中，就不得不選用抗生素基因來作為標(biāo)記基因，然而應(yīng)用抗生素基因，極易造成抗生素基因的污染，致使抗生素喪失其殺菌功能，對(duì)病原微生物的防治造成極大的不便。基于抗生素作為遺傳標(biāo)記的諸多危害，本實(shí)驗(yàn)室就使用抗生素作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建布拉氏酵母的基因敲除系統(tǒng)，以此系統(tǒng)敲除布拉氏酵母的相應(yīng)基因，構(gòu)建其營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。此營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在以后的遺傳操作中，就可以作為篩選標(biāo)記

4、。在我們實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)用此系統(tǒng)已經(jīng)成功構(gòu)建了布拉氏酵母的URA3的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，然而考慮到布拉氏酵母是二倍體菌株，單一的營(yíng)養(yǎng)缺陷型不足以滿足布拉氏酵母遺傳操作的需要，因此，我們就在URA3營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株的基礎(chǔ)上，再敲除TRP1基因，以構(gòu)建URA3/TRP1雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，進(jìn)一步完善布拉氏酵母的基因敲除系統(tǒng)。
　　本實(shí)驗(yàn)的主要目的是，在已經(jīng)敲除URA3基因的布拉氏酵母中繼續(xù)敲除TRP1基因，以構(gòu)建URA3/TRP1雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株。

5、在TRP1的敲除過程中，選用抗生素潮霉素B(HygB)來作為選擇標(biāo)記，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增已經(jīng)構(gòu)建好的HygB基因兩端帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的PZC1質(zhì)粒來構(gòu)建基因敲除盒，該基因敲除盒兩端各有一個(gè)短的可以同源重組到TRP1基因位點(diǎn)的DNA片斷，然后誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的loxP∷ble∷loxP/Cre重組酶系統(tǒng)（本文中簡(jiǎn)稱Cre質(zhì)粒）表達(dá)將陽性菌株中的HygB基因切除。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)基因敲除盒的構(gòu)建、敲除盒對(duì)