利用IVIAT技術篩選雞白痢沙門菌體內感染相關因子及pSPI12質粒的鑒定與IpaJ蛋白的功能分析.pdf

1、雞白痢沙門菌多侵害20日齡以內的幼雛，引起白色下痢，病死率極高。成年雞感染后雖然不會出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但是長期處于帶茵狀態(tài)。在成年雞的脾臟和生殖道內，細菌可以存活40周以上。在性成熟時期，細菌能侵入卵巢和輸卵管，垂直傳播給下一代。由于該菌能水平傳播和垂直傳播，對養(yǎng)禽業(yè)可造成極大的危害。目前，在西方發(fā)達國家該病已經被消滅或基本消滅，然而在個別小的禽群中仍有發(fā)生，國內禽群雞白痢的爆發(fā)仍較多。尋求雞白痢沙門菌的致病基因對于了解其致病機理及有

2、效地防治雞白痢具有重要的意義。本研究運用IVIAT(in vivoinduced antigen technology)篩選和鑒定了雞白痢沙門菌的感染相關因子，為全面認識雞白痢沙門菌的致病機理提供了基礎。
　　 沙門菌毒力質粒在細菌致病過程中發(fā)揮著重要的作用，本研究從雞白痢沙門菌分離鑒定了一個新的質粒pSPI12，并分析了該質粒上唯一的毒力相關基因ipaJ的功能，為深入了解細菌早期的感染機制提供了有利的材料。
　　 1.

3、雞白痢沙門菌S06004基因組表達文庫的構建
　　 作為禽的主要病原菌之一，雞白痢沙門菌的致病機理仍不是很清楚。本實驗采用IVIAT(體內抗原誘導技術)篩選雞白痢沙門菌的體內感染相關因子，以了解細菌體內的基因表達情況。首先，要構建雞白痢沙門菌的基因組表達文庫。將S06004的基因組用Sau3AI酶切后，回收大小在0.1 kb-4 kb的片段。同時用BamHI酶切原核系列表達載體(pET30a，b,c)，去磷酸化后，回收線性載體片

4、段。將基因組酶切的片段按適當?shù)谋壤c原核表達載體連接后，轉化大腸桿菌DH5a，挑取部分轉化子，液體培養(yǎng)后提取質粒，用載體特異性引物分析插入片段的大小分布和片段的插入率。然后從平板上提取質粒，并將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)，構建了S06004基因組的原核表達文庫。
　　 2.利用IVIAT技術篩選雞白痢沙門菌的感染相關因子
　　 獲取了十份感染了雞白痢沙門菌的陽性血清，混合后分步與S06004體外培養(yǎng)狀態(tài)下表達的抗原

5、結合去除相應的抗體，同時利用間接ELISA檢測吸附效果。然后將經過吸附處理的血清與S06004基因組表達文庫進行免疫篩選，經初次篩選和二次篩選以后，共篩選出45個陽性克隆。對陽性克隆測序后，分析其中所包含的蛋白序列。篩選獲得的蛋白涉及生物大分子合成和代謝、轉運蛋白、調控因子、能量代謝相關蛋白及功能未知蛋白等，反映了細菌在體內感染過程中，除毒力基因的表達外，細菌需要表達相關蛋白維持正常的生長代謝和應對體內不斷變化的體內環(huán)境，為揭示細菌的體

6、內活動提供了依據(jù)。
　　 3.實時熒光定量PCR檢測雞白痢沙門菌S06004感染相關因子的體內外表達差異
　　 根據(jù)IVIAT篩選獲得的陽性克隆的序列和蛋白序列同源比對結果，設計了11對S06004感染相關因子(traV、gatD、pbpC、stbC、deoR、emrB、dapA、phoQ、trkH、adhE、yhaN)的檢測引物，同時以雞傷寒沙門菌gmk基因作為內參。提取雞白痢沙門菌S06004體外液體LB培養(yǎng)的總RN

7、A，反轉錄成cDNA；以SPF雞為動物模型，采用靜脈注射的方式將體外培養(yǎng)的S06004細菌免疫，感染后在不同時間段采血，從血液中收集細菌，提取總RNA，反轉錄成cDNA，利用熒光定量PCR比較感染因子在體內外培養(yǎng)時mRNA的表達水平差異。結果表明：個別基因表現(xiàn)出很高的表達量，如phoQ;部分基因表達呈持續(xù)上升趨勢如gatD;traV、dapA、deoR、emrB和trkH呈先升后降趨勢；adhE、pbpC和stbC呈下降趨勢；yhaN呈

8、先降后升趨勢。反映了各感染相關因子在體內感染不同時間段mRNA水平并不一致，其表達水平相對于體外培養(yǎng)時有不同程度的上調。
　　 4.雞白痢沙門菌pSPI12質粒的分離與序列分析
　　 利用抑制差減雜交的方法，構建了雞白痢沙門菌與腸炎沙門菌的差減文庫，篩選獲得了雞白痢沙門菌的特異核苷酸序列。部分序列拼接形成ipaJ基因與豬霍亂沙門菌C500減毒株質粒pSFD10中的ipaJ高度同源。為了驗證雞白痢沙門菌ipaJ基因是否存在

9、于類似的質粒上，我們將卡那霉素抗性基因插入雞白痢沙門菌S06004株的ipaJ基因中，構建了插入突變株SIM12。從突變株中提取質粒，轉化大腸桿菌DH5a，卡那霉素抗性篩選陽性克隆，從中提取質粒獲得了攜帶ipaJ基因的質粒pSPI12，將質粒構建到pMD18T載體上測序分析獲得了pSPI12的完整序列和圖譜。同源性分析顯示pSPI12和pSFD10高度同源，兩者都含有一個毒力相關基因ipaJ。 PCR鑒定結果顯示本室保存的105株雞白痢

10、沙門茵分離株都含有該基因，除了豬霍亂沙門菌C500疫苗株外，其它豬霍亂沙門菌菌株和其它血清型腸道沙門菌亞種中未擴增出目的基因。Southernblot分析表明ipaJ基因只存在于質粒上。pSFD10是ColE型質粒，可以在F質粒的介導下進行接合轉移，所以我們推測豬霍亂沙門菌C500中的pSFD10質粒可能由雞白痢沙門菌中的pSPI12轉移后部分堿基突變所致。
　　 5.雞白痢沙門菌IpaJ蛋白功能的初步分析
　　 志賀氏

11、菌中的ipa負責編碼侵襲素，參與調控細菌侵入細胞的過程。為了探究雞白痢沙門菌中IpaJ蛋白的功能，構建了攜帶有ipaJ基因的回復質粒PCR(R)2.1-ipaJ,電轉化入ipaJ基因突變株SIM12株中，獲得了回復株SIM12(ipaJ)。以禽腎臟上皮細胞(CKC)為上皮細胞感染模型，比較了S06004株、SIM12株和SIM12(ipaJ)株對細胞的侵襲能力和在細胞內的增殖差異，結果顯示突變株的侵襲能力和在胞內的增殖能力明顯低于野生株

12、和回復株。由于雞白痢沙門菌以脾臟巨噬細胞作為其寄生場所，本研究以禽巨噬細胞系HD-11為巨噬細胞感染模型，比較三株細菌對細胞侵襲和在胞內增殖能力的差異，突變株的侵襲能力都明顯低于野生株和回復株，但在巨噬細胞內的增殖趨勢沒有明顯差異，都是從感染后開始到5 hr呈增長趨勢，5 hr后胞內的細菌數(shù)開始下降。體內實驗分析比較了野生株、突變株和回復株對10日齡海蘭白蛋雞的致病能力，突變株的致死率與野生株相比降低了約14倍，而回復株和野生株相當。從

13、感染的巨噬細胞和雞的脾臟細胞中提取總RNA，利用RT-PCR從感染了S06004的細胞總RNA中擴增出ipaJ基因，表明在感染過程中該基因得到了表達。Western-blot實驗顯示了體外表達的IpaJ蛋白可以與雞白痢沙門菌陽性血清反應，進一步說明IpaJ蛋白可能參與了雞白痢沙門菌對機體的感染過程，該基因的突變會導致細菌毒力的降低。
　　 綜上所述，本研究利用IVIAT技術篩選獲得了雞白痢沙門菌體內感染過程中表達的感染相關因子，

14、45個蛋白功能涉及細菌生物大分子的合成和降解、調控蛋白、運輸?shù)鞍?、能量代謝相關蛋白、噬菌體功能相關蛋白和未知功能蛋白等。選取11個因子進行實時熒光定量PCR分析，結果顯示在體內感染過程中，這些基因的表達量與體外培養(yǎng)狀態(tài)相比，都有一定程度的上調。本研究從雞白痢沙門菌中分離出了一個新的質粒pSPI12，大小為4080 bp。序列分析顯示該質粒上存在細菌毒力相關基因ipaJ，其編碼蛋白可能參與了細菌早期感染侵襲細胞的過程。動物實驗顯示ipaJ