利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建可誘導(dǎo)型豬Sohlh1基因敲除細(xì)胞系.pdf

1、據(jù)報(bào)道，小鼠Sohlh1基因的敲除會(huì)導(dǎo)致雄性不育和雌性不孕，而在豬上還沒有相關(guān)的報(bào)道。RNA引導(dǎo)的核酸酶CRISPR/Cas9是生物學(xué)研究中的一項(xiàng)革命性技術(shù)，它可以切割活細(xì)胞或者組織基因組特異性的DNA靶位點(diǎn)。本研究采用Tet-on系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)建立條件誘導(dǎo)型敲除豬Sohlh1基因的細(xì)胞系，以期為后期制備基因敲除克隆豬模型、研究Sohlh1對(duì)豬生殖和發(fā)育的影響奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先優(yōu)化Cas9基因?yàn)閑SpCa

2、s9（1.1）基因并改造plv-sgRNA載體，通過慢病毒包裝PCW-eSpCas9(1.1)載體，侵染豬胎兒成纖維細(xì)胞并進(jìn)行藥物篩選；然后通過測(cè)序分析豬Sohlh1基因CDs區(qū)，并預(yù)測(cè)Sohlh1基因Cas9蛋白靶位點(diǎn)，構(gòu)建U6-sgRNA瞬時(shí)表達(dá)元件轉(zhuǎn)染已穩(wěn)定整合Cas9基因的細(xì)胞，分析各靶位點(diǎn)的敲除活性。最后，濃縮的plv-sgRNA-2A-GFP特異性慢病毒液侵染轉(zhuǎn)eSpCas9（1.1）基因豬胎兒成纖維細(xì)胞，藥物及熒光檢測(cè)篩選

3、陽性細(xì)胞。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，（1）通過測(cè)序分析及熒光檢測(cè)，低脫靶率的PCW-eSpCas9(1.1)載體和有熒光標(biāo)記的plv-sgRNA-2A-GFP載體優(yōu)化改造成功；（2）PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞，經(jīng)Dox誘導(dǎo)檢測(cè)有Cas9表達(dá)，轉(zhuǎn)Cas9豬胎兒成纖維細(xì)胞篩選成功；（3）PCR擴(kuò)增測(cè)序?qū)Ρ确治鲐iSohlh1基因CDs區(qū)序列與NCBI報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致；（4）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)驗(yàn)證可以看出豬Sohlh1基因

4、3、4、6號(hào)靶位點(diǎn)有敲除活性，5號(hào)位點(diǎn)無敲除活性或敲除活性低，選擇構(gòu)建3、4號(hào)靶位點(diǎn)的sgRNA特異性慢病毒載體；（5）sgRNA特異性載體慢病毒原液侵染293FT細(xì)胞有熒光表達(dá)，慢病毒載體包裝成功；（6）sgRNA慢病毒濃縮液侵染轉(zhuǎn)eSpCas9（1.1）的陽性細(xì)胞，Dox誘導(dǎo)后，經(jīng)測(cè)序分析Sohlh1基因有敲除，可誘導(dǎo)型Sohlh1基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　綜上所述，本研究獲得的可誘導(dǎo)型Sohlh1基因敲除細(xì)胞系對(duì)后期基因