利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構建可誘導型豬Sohlh1基因敲除細胞系.pdf

1、據(jù)報道，小鼠Sohlh1基因的敲除會導致雄性不育和雌性不孕，而在豬上還沒有相關的報道。RNA引導的核酸酶CRISPR/Cas9是生物學研究中的一項革命性技術，它可以切割活細胞或者組織基因組特異性的DNA靶位點。本研究采用Tet-on系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術建立條件誘導型敲除豬Sohlh1基因的細胞系，以期為后期制備基因敲除克隆豬模型、研究Sohlh1對豬生殖和發(fā)育的影響奠定基礎。
　　本研究首先優(yōu)化Cas9基因為eSpCa

2、s9（1.1）基因并改造plv-sgRNA載體，通過慢病毒包裝PCW-eSpCas9(1.1)載體，侵染豬胎兒成纖維細胞并進行藥物篩選；然后通過測序分析豬Sohlh1基因CDs區(qū)，并預測Sohlh1基因Cas9蛋白靶位點，構建U6-sgRNA瞬時表達元件轉染已穩(wěn)定整合Cas9基因的細胞，分析各靶位點的敲除活性。最后，濃縮的plv-sgRNA-2A-GFP特異性慢病毒液侵染轉eSpCas9（1.1）基因豬胎兒成纖維細胞，藥物及熒光檢測篩選

3、陽性細胞。
　　試驗結果表明，（1）通過測序分析及熒光檢測，低脫靶率的PCW-eSpCas9(1.1)載體和有熒光標記的plv-sgRNA-2A-GFP載體優(yōu)化改造成功；（2）PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒轉染的陽性細胞，經Dox誘導檢測有Cas9表達，轉Cas9豬胎兒成纖維細胞篩選成功；（3）PCR擴增測序對比分析豬Sohlh1基因CDs區(qū)序列與NCBI報道的數(shù)據(jù)基本一致；（4）瞬時轉染試驗驗證可以看出豬Sohlh1基因

4、3、4、6號靶位點有敲除活性，5號位點無敲除活性或敲除活性低，選擇構建3、4號靶位點的sgRNA特異性慢病毒載體；（5）sgRNA特異性載體慢病毒原液侵染293FT細胞有熒光表達，慢病毒載體包裝成功；（6）sgRNA慢病毒濃縮液侵染轉eSpCas9（1.1）的陽性細胞，Dox誘導后，經測序分析Sohlh1基因有敲除，可誘導型Sohlh1基因敲除細胞系構建成功。
　　綜上所述，本研究獲得的可誘導型Sohlh1基因敲除細胞系對后期基因